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辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响
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作者 杨蒙 薛正莲 +3 位作者 甘玉飞 周杰 王洲 刘艳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第6期104-110,共7页
为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1(phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基... 为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1(phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基因plaS进行了剪接,并对各截短菌株进行酶活检测和酶学性质分析。结果表明:PlaS属于锚蛋白(ankyrin,ANK)家族,主要由N端域、ANK结构域、C端域三部分组成,其中ANK结构域包含4个典型的ANK重复序列(ANK repeat)。从构建的5株截短菌株中筛选出了2株胞外酶活相对较高的菌株AN-3与AN-4,与未截短菌株BP28相比,比酶活分别提高了73%和78%,催化效率(K_(cat)/K_(m))分别提高了216%和211%,而最适温度(45℃)和最适pH值(6.0)没有发生变化。K_(cat)/K_(m)的结果显示,在所有的截短菌株中AN菌株的催化效率最低。plaS剪接结果表明,PlaS的ANK结构域至少需要3个ANK repeat才会对PlaA1酶活表现为胞外促进作用,PlaS的C端域对维持PlaA1的结构稳定性起到重要的作用,研究为揭示PlaS对PlaA1的调控机制提供了理论基础。 展开更多
关键词 磷脂酶A1 磷脂酶A1辅助蛋白 锚蛋白重复序列 基因剪接 酶学性质 分子截短
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黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白S对表达宿主菌大肠杆菌抑制作用机制
2
作者 甘玉飞 薛正莲 +3 位作者 周杰 王芳 王洲 刘艳 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第7期45-51,共7页
黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本实验通过对PlaS进行生物信息学分... 黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本实验通过对PlaS进行生物信息学分析并对其N端截短系列表达菌株的生长特性进行研究以确定其抑制作用关键区域,并通过扫描电子显微镜观察和流式细胞仪检测来初步探究PlaS对表达宿主菌的抑制机理。结果表明,在PlaS N端分别截短前23、24、25、26、27个氨基酸构建的表达菌株中,dS_(23)P_(28)、dS_(24)P_(28)、dS_(25)P_(28)、dS_(26)P_(28)菌株仍表现出不同程度的生长抑制现象,而dS_(27)P_(28)菌株没有出现生长抑制现象,初步表明PlaS N端的前27个氨基酸为抑制关键区域。扫描电子显微镜和流式细胞仪结果显示,PlaS的表达对大肠杆菌的细胞膜有严重的破坏作用,而N端截短前27个氨基酸的PlaS表达后对大肠杆菌细胞膜的损伤作用消失,这一结果也与生长特性结果一致。本实验结果可为深入研究黏质沙雷菌PlaS功能提供理论参考。 展开更多
关键词 黏质沙雷菌 磷脂酶A1辅助蛋白 大肠杆菌 生长抑制 N端截短
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磷脂酶A1辅助蛋白N端截短菌株的构建及其优化表达 被引量：3
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作者 朱昊 薛正莲 +2 位作者 王洲 陈阿娜 杨蒙 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期34-38,45,共6页
根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dS... 根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD_(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD_(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD_(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。 展开更多
关键词 磷脂酶A1辅助蛋白PlaS N端截短 原核表达 表达条件优化
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