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奶牛乳腺炎无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因主要抗原区域的融合表达及抗原性鉴定 被引量：9
1
作者 吴金花 布日额 +6 位作者 王金良 陈金龙 锡林高娃 孙立杰 王华 杜长智 白文丽 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1292-1299,共8页
为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar... 为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk及纤连蛋白FbsA三重活性的多亚单位融合蛋白,研究其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性,根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk及FbsA基因的核苷酸序列,利用DNAStar软件对蛋白的抗原表位序列进行分析并设计合成包括重叠PCR引物共4对引物,通过重叠PCR技术将前2个基因主要抗原区域进行拼接后插入pET30a(+)载体,再将第3个基因插入。为减少三重基因串联表达过程中3个蛋白之间空间构象的干扰,在3个基因连接处各引入1段45bp的柔性linker,结果重组基因在BL21感受态中实现了可溶性表达,表达的蛋白约62 000;Western blot试验表明多亚单位融合蛋白可被无乳链球菌多抗识别,且由此融合蛋白制备小鼠多抗能够识别sip、pgk及FbsA等3个蛋白;这表明构建的多亚单位融合蛋白可能具备sip、pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保护性试验中,重组多亚单位融合抗原对攻毒小鼠的保护优于单个蛋白。本试验为牛无乳链球菌性乳腺炎新型疫苗的研究提供了一定的参考数据。 展开更多
关键词 无乳链球菌 sip基因 pgk基因 FbsA基因 主要抗原区域 融合表达
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奶牛乳腺炎无乳链球菌pgk基因的克隆与序列分析 被引量：9
2
作者 张海宝 布日额 +5 位作者 王学理 吴金花 孙立杰 唐吉思 锡林高娃 刘燕 《中国病原生物学杂志》 CSCD 2011年第2期90-92,共3页
目的获得牛乳腺炎无乳链球菌分离菌株pgk基因序列,分析其基因与氨基酸的同源性。方法参考Gen-Bank上公布的牛源无乳链球菌pgk基因序列设计合成1对引物,通过PCR扩增获得其序列并进行克隆与测序分析。结果所扩增的pgk基因序列的大小为1 19... 目的获得牛乳腺炎无乳链球菌分离菌株pgk基因序列,分析其基因与氨基酸的同源性。方法参考Gen-Bank上公布的牛源无乳链球菌pgk基因序列设计合成1对引物,通过PCR扩增获得其序列并进行克隆与测序分析。结果所扩增的pgk基因序列的大小为1 197 bp,负责编码399个氨基酸残基。对比扩增的分离菌株pgk基因序列与GenBank上公布的B群无乳链球菌pgk基因(AE009948)相似性达到99.83%,编码的氨基酸序列相似性达到99.74%。结论该基因序列具有高度的保守性,为进一步对分离菌株的pgk基因进行高效表达及其产物的抗原性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 无乳链球菌 pgk基因 克隆 序列分析
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LAMP快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病 被引量：6
3
作者 曾丹丹 戎振洋 +2 位作者 袁咏天 王晓莉 郑小波 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期286-292,共7页
[目的]水稻恶苗病是为害水稻生长发育的重要病害,在我国的分布非常广泛,经常会造成严重的损失。拟轮枝镰孢是引起水稻恶苗病的重要病原菌,本研究意在建立由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断技术。[方法]基于环介导等温扩增(loop-me... [目的]水稻恶苗病是为害水稻生长发育的重要病害,在我国的分布非常广泛,经常会造成严重的损失。拟轮枝镰孢是引起水稻恶苗病的重要病原菌,本研究意在建立由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断技术。[方法]基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase)基因Pgk为靶标,设计筛选LAMP特异性引物。[结果]建立了可直接从水稻恶苗病植株中检测拟轮枝镰孢并诊断由该病原菌引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术(FvPgk-LAMP)。该检测技术可以从田间发病的水稻植株中直接对病原菌进行检测,反应条件为62℃、70 min。由于反应前在反应管内加入了羟基萘酚蓝(HNB),反应结束后可对结果进行直接判定,阳性反应呈天蓝色,阴性反应则仍然为紫色。该体系的最低检出限为目标菌纯DNA的100pg·μL^(-1)。应用该技术我们已成功且快速地对来自江苏南京和镇江的水稻恶苗病样本进行了病害诊断。[结论]本研究为拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的诊断提供了快速且有效的新技术。 展开更多
关键词 水稻恶苗病 拟轮枝镰孢 环介导等温扩增技术(LAMP) pgk基因
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鸡磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的差异表达与低氧适应性 被引量：4
4
作者 王存芳 苑存忠 +2 位作者 张劳 吴常信 李宁 《中国科学（C辑）》 CSCD 北大核心 2007年第2期178-184,共7页
通过测序检测了藏鸡、白莱航鸡和寿光鸡调节细胞葡萄糖代谢的糖酵解酶磷酸甘油酸激酶(PGK)编码基因的基因组序列,发现了4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为藏鸡与其他两个品种之间的差异.实验表明其中1个SNP即外... 通过测序检测了藏鸡、白莱航鸡和寿光鸡调节细胞葡萄糖代谢的糖酵解酶磷酸甘油酸激酶(PGK)编码基因的基因组序列,发现了4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为藏鸡与其他两个品种之间的差异.实验表明其中1个SNP即外显子10上第59位A→G突变(第379位氨基酸由M变为T)后具有低氧诱导因子(HIF-1)结合位点,即含有低氧应答元件(HRE).机体受低氧刺激时HRE与HIF-1的结合活性会相应增加.低氧孵化可导致胚胎死亡率升高,且发育正常胚胎A→G的突变率非常高,具有低氧适应性.研究指出,PGK基因的M→T突变是低氧适应有利突变,在低氧刺激下,低氧诱导因子-1将上调骨骼肌组织糖酵解酶PGK基因的表达,利用糖酵解途径为机体提供能量,满足机体活动需要,进而适应外界环境. 展开更多
关键词 藏鸡 低氧适应性 pgk基因 差异表达
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牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析 被引量：1
5
作者 张海宝 布日额 +6 位作者 吴金花 王学理 孙立杰 唐吉思 锡林高娃 刘燕 张忠祥 《中国动物传染病学报》 CAS 2011年第1期39-44,共6页
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase,Pgk)基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、... 为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase,Pgk)基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因(AE009948)核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体Pgk-pET30a(+),再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2+亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 展开更多
关键词 无乳链球菌 pgk基因 原核表达 抗原性
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奶牛乳腺炎无乳链球菌sip与pgk双基因主要抗原区域的融合表达 被引量：9
6
作者 布日额 吴金花 +3 位作者 王金良 锡林高娃 刘燕 乌日汗 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1228-1231,共4页
为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk双重活性的融合蛋白,探讨其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性。根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk基因的核苷酸序列,设计合成4条引物,通过重叠PCR技术将2个基... 为获得具有无乳链球菌膜表面相关蛋白sip和磷酸甘油激酶pgk双重活性的融合蛋白,探讨其作为无乳链球菌亚单位疫苗候选抗原的可行性。根据GenBank中已发表的无乳链球菌sip、pgk基因的核苷酸序列,设计合成4条引物,通过重叠PCR技术将2个基因主要抗原区域进行融合表达;在2个基因连接处引入45bp连接肽的核苷酸序列;重组蛋白通过pET30a(+)载体及BL21表达菌实现原核表达,表达的蛋白大小约为47 000;Western blot检测表明,重组蛋白可被无乳链球菌多抗识别,具有较好地免疫生物学活性。本研究为奶牛乳腺炎无乳链球菌亚单位疫苗的研发提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 无乳链球菌 sip、pgk基因 融合表达
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拟南芥PGK基因家族功能的初步分析 被引量：4
7
作者 黄小贞 赵懿琛 《山地农业生物学报》 2017年第1期12-17,35,共7页
磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一类进化上非常保守的蛋白家族,因而利用模式植物拟南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意义。拟南芥基因组中含有三个PGK基因家族成员(PGK1,PGK2和PGK3),但是对于它们的基因表达模式和蛋白定位... 磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一类进化上非常保守的蛋白家族,因而利用模式植物拟南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意义。拟南芥基因组中含有三个PGK基因家族成员(PGK1,PGK2和PGK3),但是对于它们的基因表达模式和蛋白定位的研究还不是很清楚。本文利用实时荧光定量PCR技术检测了PGK基因家族的表达模式,结果表明三个PGK基因在拟南芥的各个组织器官和发育阶段中都有表达。利用拟南芥原生质体瞬时转化系统对三个PGK蛋白进行亚细胞定位,结果显示PGK1和PGK3定位于细胞基质,而PGK2定位于叶绿体。另外,我们分离得到了PGK2基因的T-DNA插入敲除突变体pgk2。pgk2在正常条件下表现出叶片黄化,PR1基因上调表达和H_2O_2过量积累等类似于超敏反应的细胞死亡表型。进一步的遗传分析表明pgk2的细胞死亡表型和T-DNA插入位点紧密连锁,暗示着pgk2的细胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的,因此PGK2可能在调控植物细胞程序化死亡过程中有重要作用。以上研究结果对于进一步探讨PGK基因家族的功能具有重要的参考价值。 展开更多
关键词 拟南芥 pgk基因家族 蛋白定位 细胞死亡
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酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆 被引量：9
8
作者 刘玉方 朱邦民 蔡金科 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第1期21-27,共7页
含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal3... 含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。 展开更多
关键词 pgk1基因 启动子 亚克隆 酿酒酵母
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猬草及其近缘属植物单拷贝核Pgk1基因序列的系统发育分析 被引量：2
9
作者 凡星 廖莎 +3 位作者 沙莉娜 刘静 王晓丽 周永红 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1049-1058,共10页
文章对禾本科小麦族猬草属及其近缘属Thinopyrum(Eb)、Lophopyrum(Ee)、拟鹅观草属(St)、新麦草属(Ns)、大麦属(H)、赖草属(NsXm)和披碱草属(StH)植物共23个类群的单拷贝核Pgk1基因序列进行系统发育分析,探讨猬草属及其近缘属植物的系... 文章对禾本科小麦族猬草属及其近缘属Thinopyrum(Eb)、Lophopyrum(Ee)、拟鹅观草属(St)、新麦草属(Ns)、大麦属(H)、赖草属(NsXm)和披碱草属(StH)植物共23个类群的单拷贝核Pgk1基因序列进行系统发育分析,探讨猬草属及其近缘属植物的系统发育关系。序列分析发现Pgk1基因序列在L.arenarius和Psa.juncea中有81bp的Stowaway家族DNA转座元件插入,而在Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata和L.akmolinensis中有29bp Copia家族的反转录转座元件插入。最大似然和贝叶斯推断进行的系统发育分析表明:(1)猬草属模式种Hy.patula与披碱草属、拟鹅观草属和大麦属具有密切的亲缘关系;(2)猬草属的其他物种Hy.duthiei、Hy.duthieissp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii与新麦草属和赖草属植物亲缘关系密切。研究结果支持将Hy.patula从猬草属组合到披碱草属中,而Hy.duthiei、Hy.duthieis sp.longearistata、Hy.coreana和Hy.komarovii应组合到赖草属中。 展开更多
关键词 pgk1基因 猬草属 赖草属 基因组 系统发育
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人PGK1基因真核表达载体的构建及其功能检测 被引量：1
10
作者 王圣尧 罗沙柳 +1 位作者 叶棋浓 刘婕 《军事医学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期507-511,共5页
目的构建带FLAG标签的人癌基因磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase1,PGK1)的真核表达载体,并验证其表达产物的生物学功能。方法采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人PGK1基因,并将其克隆到真核载体pc DNA3. 0-FLAG上,酶切鉴定和测序... 目的构建带FLAG标签的人癌基因磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase1,PGK1)的真核表达载体,并验证其表达产物的生物学功能。方法采用PCR技术从人乳腺文库中扩增人PGK1基因,并将其克隆到真核载体pc DNA3. 0-FLAG上,酶切鉴定和测序鉴定后,通过Western印迹检测其表达;将FLAG-PGK1载体转染乳腺癌细胞ZR75-1,利用乳酸试剂盒测定乳腺癌细胞外乳酸含量,并通过CCK8法和划痕实验测定乳腺癌细胞的生长和迁移。结果从乳腺文库中,PCR扩增出约1260 bp DNA片段,克隆到pc DNA3. 0-FLAG载体上,测序结果与目的序列一致。Western印迹检测到目的基因表达,且位置正确。乳酸含量测定结果显示,PGK1可促进细胞乳酸含量增加;细胞生长曲线结果显示,转染FLAG-PGK1的乳腺癌细胞生长较空载体生长快;细胞划痕实验表明PGK1促进细胞迁移。结论成功构建了FLAG-PGK1的真核表达载体,其表达促进了乳腺癌细胞生长和迁移,同时也促进了乳酸的增加,为进一步研究PGK1在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 人pgk1基因 克隆 真核表达 乳腺癌细胞 磷酸甘油酸激酶
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