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结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究 被引量：18
1
作者 江山 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 陈全 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期305-309,共5页
目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组... 目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+psIL12DNA疫苗治疗组。感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,x±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05)。psIL12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05);pcD85B+psIL12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义。pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNFα水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL4水平差异无统计学意义。生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织? 展开更多
关键词 免疫治疗作用 DNA疫苗 结核病 肿瘤坏死因子α(TNF-α) 小鼠 实验研究 pcdna3.1 结核分枝杆菌感染 pcdna3.1 IFN-γ AG85B 肺组织病理改变 生理盐水 白细胞介素 真核表达质粒 对照组 治疗组 细胞特异性 脾淋巴细胞 纤维母细胞
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pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达 被引量：6
2
作者 詹升华 张徽 刘纯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期390-393,共4页
目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真... 目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。 展开更多
关键词 人促甲状腺激素受体 pcdna3.1 COS-7细胞 转染 动物模型
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人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建 被引量：8
3
作者 安珂 田玉科 +2 位作者 杨辉 高峰 王鹏 《中国疼痛医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期167-170,共4页
目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE... 目的构建人前脑啡肽原(hPPE)基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法采用DNA重组技术将质粒pCMVhPPE.SEQ中的人前脑啡肽原基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,经酶切鉴定和测序分析后,采用脂质体介导法将重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE和空质粒pcDNA3.1(+)分别转染永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST)。经G418(600μg/ml)筛选,挑选阳性克隆并扩大培养。采用免疫细胞化学法、RTPCR和放射免疫法检测转染细胞亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达及分泌,同时检测Neo基因的存在以证实转染成功。结果重组质粒经酶切后分别出现5.4kb和950bb片段,测序分析与文献报道结果一致,表明重组质粒pcDNA3.1(+)hPPE亚克隆成功。Neo基因检测显示重组质粒和空质粒已成功转染至IAST中,筛选获得IAST/hPPE和IAST/Neo两个细胞株,LEK免疫染色均阳性,但平均光密度结果显示IAST/hPPE的LEK表达明显强于IAST/Neo和IAST(P<0.01)。IAST/hPPE细胞与IAST/Neo和IAST细胞相比,hPPEmRNA表达水平和培养上清液中LEK的分泌量明显增高(P<0.01),而IAST与IAST/Neo细胞相比无显著性差异(P>0.05)。结论成功构建了人前脑啡肽原基因修饰的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/hPPE),为该细胞移植用于镇痛的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 前脑啡肽原 星形胶质 基因修饰 细胞株 永生化 大鼠 pcdna3.1(+) DNA重组技术 免疫细胞化学法 重组质粒 真核表达载体 脂质体介导法 亮氨酸脑啡肽 RT-PCR L-EK mRNA表达 免疫法检测 Neo基因 平均光密度 培养上清液 显著性差异
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传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的真核表达及免疫原性检测 被引量：5
4
作者 刘兆球 姜世金 常维山 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期241-243,共3页
为了探讨S1基因在DNA免疫防制传染性支气管炎(IB)中的免疫原性,将IBVZ株S1基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNAIBVZS。在脂质体作用下将pcDNAIBVZS转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中... 为了探讨S1基因在DNA免疫防制传染性支气管炎(IB)中的免疫原性,将IBVZ株S1基因插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中,构建了真核表达质粒pcDNAIBVZS。在脂质体作用下将pcDNAIBVZS转染CEF细胞,用间接免疫荧光试验检测,在CEF细胞中可见有大量S1蛋白表达。将重组质粒以100μg/只的剂量肌注免疫SPF雏鸡,经间接ELISA试验检测二免前后的血清,结果显示,pcDNAIBVZS基因可在SPF鸡体内诱导相应抗体的产生,具有特定的免疫原性。 展开更多
关键词 传染性支气管炎病毒 免疫原性 S1基因 pcdna3.1 真核表达质粒 间接免疫荧光 试验检测 SPF雏鸡 ELISA 免疫防制 基因插入 蛋白表达 重组质粒 SPF鸡 CEF IBV 脂质体 S基因 细胞 肌注 抗体
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3p21·3区域肺癌相关基因RASSF1A的抑癌功能研究 被引量：8
5
作者 张森 邵康 +4 位作者 张翠艳 周芳 王伟 熊美华 赫捷 《中华医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第13期908-911,共4页
目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3·1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化。方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3·1,pcDNA3·1-RASSF1A分别转染入A549细... 目的观察将野生型RASSF1A通过质粒载体pcDNA3·1导入不表达该基因的非小细胞肺癌(NSCL)细胞系A549后,肺癌细胞生物学特性的变化。方法通过脂质体Lipofectamine2000将质粒载体pcDNA3·1,pcDNA3·1-RASSF1A分别转染入A549细胞系中,通过流式细胞仪检测瞬时转染该基因对细胞周期的影响以及是否诱发凋亡;通过绘制细胞生长曲线,MTT检测,以及集落形成实验来分析稳定转染细胞的生物学特性;同时分析稳定转染RASSF1A对A549细胞裸鼠转移能力的影响。结果瞬时转染RASSF1A使细胞周期阻断在G1/S期(P<0·001);稳定转染该基因的细胞其增殖能力和集落形成能力均显着下降(P<0·01),同时裸鼠转移能力也明显被抑制(P<0·01)。结论野生型RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制肿瘤细胞的生长和转移,提示该基因在肺癌的发生发展中发挥重要作用。 展开更多
关键词 3p21.3区域 肺癌相关基因 功能研究 pcdna3.1 RASSF1A基因 细胞生物学特性 A549细胞系 流式细胞仪检测 抑癌 非小细胞肺癌 细胞生长曲线 稳定转染细胞 集落形成实验 细胞周期阻断 集落形成能力 抑制肿瘤细胞 质粒载体
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牛妊娠相关糖蛋白1(bPAG1)的真核表达及纯化 被引量：7
6
作者 刘长彬 卢春霞 +2 位作者 杨华 张云生 石国庆 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2019年第8期1944-1949,共6页
[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载... [目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 牛妊娠相关糖蛋白 重组蛋白 真核表达 pcdna3.1(-)
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流感病毒血凝素基因HA1区的克隆及其真核表达载体的构建 被引量：6
7
作者 曹康 张卫东 +4 位作者 李虹 李婉宜 蒋中华 庄永华 李明远 《中国人兽共患病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期11-13,共3页
目的　克隆甲型流感病毒血凝素基因HA1区及构建其真核表达载体。方法　从接种人流感病毒株A/PR/ 8/ 34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA ,用特异引物进行RT PCR ,扩增血凝素基因HA1区。将所扩增片断克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+) ... 目的　克隆甲型流感病毒血凝素基因HA1区及构建其真核表达载体。方法　从接种人流感病毒株A/PR/ 8/ 34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA ,用特异引物进行RT PCR ,扩增血凝素基因HA1区。将所扩增片断克隆入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+) ,转化感受态大肠杆菌JM 10 9并筛选阳性克隆。结果　经双酶切、PCR及测序鉴定证实血凝素基因HA1区的真核表达载体构建成功。结论　甲型流感病毒血凝素的HA1区是与宿主细胞膜表面受体结合的部位并起着诱导机体产生保护性抗体的作用 ,HA1区的克隆和其真核表达质粒的构建将为防治病毒侵入宿主细胞及核酸疫苗的研究打下基础。 展开更多
关键词 流感病毒 血凝素 pcdna3.1(+)
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甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达 被引量：3
8
作者 钟利 李婉宜 +3 位作者 李明远 李虹 张卫东 蒋忠华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期366-369,共4页
目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/N... 目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 NP基因 pcdna3.1(+) 免疫荧光技术
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人MxA基因重组真核载体的构建及鉴定 被引量：2
9
作者 黄琴 赵瑞秋 +1 位作者 刘爱平 许红梅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2008年第2期152-154,249,共4页
目的:应用真核载体PcDNA3.1构建含我国健康人目的基因MxA的重组真核载体PcDNA3.1-MxA。方法:在大肠杆菌JM109中扩增前期已构建的含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和真核载体PcDNA3.1,使用两者共同的限制性内切酶XbaⅠ、NotⅠ进行双酶切,... 目的:应用真核载体PcDNA3.1构建含我国健康人目的基因MxA的重组真核载体PcDNA3.1-MxA。方法:在大肠杆菌JM109中扩增前期已构建的含有目的基因MxA的PAdtrack-MxA和真核载体PcDNA3.1,使用两者共同的限制性内切酶XbaⅠ、NotⅠ进行双酶切,并连接以构建重组真核载体PcDNA3.1-MxA,然后通过氨苄青霉素抗性筛选,双酶切及PCR鉴定,选取鉴定正确的克隆测序,并应用DNAssist 2.0软件对序列与前期获得的基因序列以及已知GenBank中MxA基因序列进行同源性分析。结果:经限制性内切酶、PCR鉴定重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功。测序结果表明本实验所克隆片段长2012bp,包含人MxA基因序列,核苷酸序列分析表明与前期获得的目的基因序列完全相同,而与GenBank中人MxA基因序列同源性也达99.75%,仅有5个碱基不同,且所编码的氨基酸仅1个发生改变,此氨基酸位于MxA蛋白的非功能区。结论:重组真核载体PcDNA3.1-MxA构建成功,为下一步研究MxA抗乙型肝炎病毒作用奠定了基础。 展开更多
关键词 MXA pcdna3.1 pcdna3.1-MxA
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甲型流感病毒核蛋白基因的真核质粒的构建及其表达 被引量：6
10
作者 冯润 孙坚 +2 位作者 王农荣 杨斌 何士勤 《江西医药》 CAS 2010年第1期9-11,共3页
目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白(nucleoprotein,NP)基因的真核表达载体,转染Hela细胞,并用甲型流感病毒检测试剂盒(FluARapidTestKit)检测其表达情况。方法用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,将其插... 目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白(nucleoprotein,NP)基因的真核表达载体,转染Hela细胞,并用甲型流感病毒检测试剂盒(FluARapidTestKit)检测其表达情况。方法用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,将其插入到真核表达质粒pcDNA3.1(+)。酶切、PCR、测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染到Hela细胞,通过甲型流感病毒检测试剂盒检测其蛋白表达。结果克隆出一个核苷酸长度为1432bp的基因,和A/PR/8/34(H1N1)(GenBank/NCB,GI:8486129)有98%的同源性,转染Hela细胞后用甲型流感病毒检测试剂盒检测到24h、48h、72h细胞内外的蛋白表达。结论成功构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)核蛋白基因的真核表达质粒,为进一步研究理化因素对该基因的影响、基因的结构和功能打下良好的基础。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 核蛋白 真核载体
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Aβ_(1-15)多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果 被引量：5
11
作者 张革 汪华侨 +5 位作者 邹俊涛 李国营 袁群芳 林贤 姚志彬 张革 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期371-376,共6页
【目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.... 【目的】构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果。【方法】基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgGκ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.1表达载体,构建pcDNA3.1-s4×Aβ15真核表达质粒;质粒转染COS-7细胞,Westernblot检测4×Aβ15的表达;质粒肌肉注射接种BALB/c鼠,共6次,18周加强免疫,ELISA法检测抗体效价以及抗体分型;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合。【结果】测序证实所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15载体序列正确,在COS-7细胞中表达分子质量约8ku的分泌型4×Aβ15蛋白。pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体,随加强免疫次数增多,抗体滴度增加,在19周,抗体平均滴度为1︰6400,抗体以IgG1型为主,且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和。【结论】所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体,为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件。 展开更多
关键词 多价DNA疫苗 体液免疫 COS-7细胞 pcdna3.1 ELISA法检测 Western BALB/C鼠 linker 真核表达质粒 BLOT检测 免疫组织化学 抗体平均滴度 基因片段 加强免疫 转基因鼠 AΒ42 PCR技术 信号肽序列 转基因动物 老年性痴呆 基因合成
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目的基因大小对脂质体转染效率影响的研究 被引量：4
12
作者 丁旭 郭佳琦 +5 位作者 张嘉琪 解宇浩 徐连秀 狄文慧 聂文营 郝峰 《吉林医药学院学报》 2020年第4期265-267,共3页
目的研究使用脂质体转染时目的基因大小对转染效率影响。方法将大小差异显著的目的基因连接到同一载体,脂质体转染法分别将上述两种目的基因转染至FRT细胞,转染完成24 h后,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,检测目的基因的... 目的研究使用脂质体转染时目的基因大小对转染效率影响。方法将大小差异显著的目的基因连接到同一载体,脂质体转染法分别将上述两种目的基因转染至FRT细胞,转染完成24 h后,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率,检测目的基因的大小对转染效率的影响。结果转染效率均随着脂质体用量增加而上升,无论脂质体浓度如何选择,两种真核表达载体的转染效率均有显著性差异,且目的基因越大,转染效率越低。结论目的基因与转染效率成反比。 展开更多
关键词 FRT细胞 pcdna3.1 脂质体 转染 目的基因大小
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膜联蛋白A2质粒的构建及其在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中的作用 被引量：3
13
作者 孟倩 张曼 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期511-517,共7页
目的膜联蛋白A2(annexin A2,Anxa2)在多种肿瘤细胞中具有调节生物活性的作用。本研究旨在探讨Anxa2蛋白的表达与膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移的相关性。方法扩增ANXA2序列,插入pcDNA3.1(+)载体,制备pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒。用脂质体lipo... 目的膜联蛋白A2(annexin A2,Anxa2)在多种肿瘤细胞中具有调节生物活性的作用。本研究旨在探讨Anxa2蛋白的表达与膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移的相关性。方法扩增ANXA2序列,插入pcDNA3.1(+)载体,制备pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒。用脂质体lipo2000将pcDNA3.1(+)-ANXA2瞬时转染至pumc-91膀胱癌细胞中。Western blotting检测空白组、转染pcDNA3.1(+)空载的对照组和转染pcDNA3.1(+)-ANXA2质粒的实验组中Anxa2蛋白的表达。利用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测pumc-91细胞的增殖能力,transwell实验检测pumc-91细胞的迁移水平。采用单因素方差分析或重复测量的方差分析比较各组间检测数据的差异。结果PcDNA3.1(+)-ANXA2质粒构建成功,测序完全正确。Western blotting检测显示,与空白组和对照组相比,实验组Anxa2蛋白表达水平增高。CCK8实验显示实验组增殖的pumc-91细胞数量相比于空白组(P<0.001)和对照组(P=0.001)明显增多;transwell实验中实验组穿膜的pumc-91细胞数量较空白组(P=0.011)和对照组(P=0.027)也明显增多。结论Anxa2蛋白的表达上调可能在膀胱癌pumc-91细胞增殖和迁移中起重要作用。 展开更多
关键词 膜联蛋白A2 膀胱癌 pcdna3.1(+) 增殖 迁移
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绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定 被引量：4
14
作者 杨健 任碧轩 唐恩洁 《川北医学院学报》 CAS 2005年第2期123-125,共3页
目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转... 目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。 展开更多
关键词 表达质粒 鉴定 绿色荧光蛋白报告基因 pcdna3.1 限制性核酸内切酶 HepG2细胞 pcdna3 限制性内切酶 基因片段 蛋白表达 细胞表达 表达载体 哺乳动物 融合表达 表达定位 组方法 多克隆 克隆人 分析后 转染
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减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达弓形虫SAG1基因 被引量：3
15
作者 曲道峰 王素华 +1 位作者 蔡渭明 杜爱芳 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期188-192,共5页
将PCR扩增获得的弓形虫SAG1基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和phoP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vero细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30ku... 将PCR扩增获得的弓形虫SAG1基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建成pcDNA3-SAG1真核表达质粒,高压电转化入dam和phoP基因双突变的减毒沙门氏菌(ZJ111株)中,并直接转染Vero细胞,胰酶消化、收集细胞,SDS-PAGE和western blot可检测到30ku左右的蛋白条带和印迹带。结果表明减毒沙门氏菌能将外源基因呈递给Vero细胞并进行表达。 展开更多
关键词 SAG1基因 pcdna3.1 真核表达 VERO细胞
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pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白在大鼠鞘内注射的表达 被引量：3
16
作者 徐玉英 曹靖 +2 位作者 任秀花 赵青赞 臧卫东 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期339-341,共3页
目的：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应... 目的：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）并观察其存大鼠体内的转染部位及表达时间。方法：构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-增强型绿色荧光蛋白后直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察其存大鼠体内转染后的时空效应。结果：双酶切结果符合真核表达载体pcDNA3.1（＋）约5.4kb，EGFP约750bp，另外测序分析与文献报道结果完全一致；动物实验结果表明，鞘内注射24h后存大鼠的脑脊膜和脊神经的外膜上有EGFP表达，在14d达到高峰，4周后明显下降，第7周消失；在实验组大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有绿色荧光。对照组所有取材部位均没有绿色荧光。结论：重组质粒pcDNA3.1（＋）-EGFP通过直接注射法被成功转染至大鼠的蛛网膜下腔，且外源基因得到了表达。 展开更多
关键词 鞘内注射 增强型绿色荧光蛋白 真核表达 pcdna3.1
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多发性骨髓瘤MUCl-2VNTR真核表达载体构建及鉴定 被引量：3
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作者 罗云娇 刘昆 +4 位作者 刘月波 杨红 姚锦 邵亮 张铀 《白血病．淋巴瘤》 CAS 2008年第5期334-336,共3页
目的构建多发性骨髓瘤（MM）黏蛋白MUCl-2VNTR基因的真核表达载体，为研制MM基因疫苗奠定基础。方法以MUCl-2VNTR的编码基因作为目的基因，在其前端加上COZAK序列后，两端分别加上HindⅢ和XbaI酶酶切位点，将人工合成的全基因定向克隆入... 目的构建多发性骨髓瘤（MM）黏蛋白MUCl-2VNTR基因的真核表达载体，为研制MM基因疫苗奠定基础。方法以MUCl-2VNTR的编码基因作为目的基因，在其前端加上COZAK序列后，两端分别加上HindⅢ和XbaI酶酶切位点，将人工合成的全基因定向克隆入pcDNA3．1／myc-hisB中，并通过酶切及测序进行鉴定。结果合成的MUCl-2VNTR基因全长约140bp，所构建的pcDNA3．11MUCl-2VNTR／myc-hisB重组体经双酶切及测序鉴定后，与预期片断大小相符，并含有完整的阅读框架和目的基因，证明构建成功。结论成功地构建了MM真核表达载体pcDNA3．1／MUCl-2VNTR／myc-hisB，为MUCl黏蛋白的功能研究和MM基因疫苗的研制奠定了相应的实验基础。 展开更多
关键词 多发性骨髓瘤 MUCl黏蛋白 pcdna3.1 载体构建
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hTSHR188-403bp基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型 被引量：3
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作者 赵紫琴 李兰英 朱云娟 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期153-156,共4页
目的:构建pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp)重组质粒,并将其基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型。方法:RT-PCR扩增hTSHR膜外区188～403bp,与pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/hTSHR,用酶切、PCR及测序方法进行鉴定。于1、4、7、... 目的:构建pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp)重组质粒,并将其基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型。方法:RT-PCR扩增hTSHR膜外区188～403bp,与pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/hTSHR,用酶切、PCR及测序方法进行鉴定。于1、4、7、9、10周将重组体免疫实验组小鼠,对照组注射生理盐水,0、6、11周取血,检测血清TRAb、T4、TSAb、TBAb。取甲状腺常规病理切片,HE染色镜检。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定证明插入方向正确,测序结果与GeneBank中hTSHR的相应片段序列相同。免疫组T4、TRAb和TSAb水平均从第6周开始显著升高(P<0.05),TBAb差异无统计学意义(P>0.05),对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组甲状腺病理检查结果,显示滤泡增生,胶质浓缩等Graves’病的病理表现,对照组形态正常。结论:构建了重组质粒pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp),成功建立了类Graves’病动物模型。 展开更多
关键词 基因免疫 pcdna3.1 TSH受体 Graves’病 动物模型
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c-fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理大鼠心肌细胞保护作用的实验研究 被引量：1
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作者 胡安根 黄跃生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第18期1599-1601,共3页
目的　探讨c fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用。方法　烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混合气体作为缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c fos反义基因重组体 ;由Li pofectaminekit介... 目的　探讨c fos反义基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞的保护作用。方法　烧伤血清采自 3 0 %TBSAⅢ度烫伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混合气体作为缺氧模型 ;采用基因重组技术构建c fos反义基因重组体 ;由Li pofectaminekit介导心肌细胞转染 ;于缺氧复合烧伤血清处理 1,3 ,7h不同时相点采用RT PCR检测c fosmRNA的表达变化 ,采用Westernblot检测c fos蛋白 ,肌钙蛋白 T(TnT)和 β 微管蛋白 ( β Tubulin)的表达变化。 结果　加入烧伤血清并造成缺氧的非转染心肌细胞 (下文称非转染组 ) ,c fosmRNA和蛋白显著表达 ,3h达到最高峰 ,与正常对照组比较 ,TnT和 β Tu bulin表达显著下降 ,7h降至最低水平 ;转染c fos反义基因重组体 (下文称转染组 )后 ,c fosmRNA和蛋白表达显著下降 ,TnT和 β Tubulin表达却显著回升。 结论　缺氧复合烧伤血清处理产生的c fos会引起心肌细胞损伤 ,c fos反义基因重组体转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞具有保护作用。 展开更多
关键词 β—微管蛋白 肌钙蛋白—T 反义基因 缺氧 烧伤血清 C-FOS 基因转染 pcdna3.1(+)
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禽呼肠孤病毒σ_2基因的真核表达及其免疫效果研究 被引量：3
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作者 邓显文 谢芝勋 +3 位作者 谢丽基 谢志勤 刘加波 庞耀珊 《湖南农业科学》 2011年第1期126-129,133,共5页
采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARV S1133毒株和广西分离株R1的σ2基因,将σ2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,对获得的重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定。结果表明,插入的片段为σ2目的基因,插入的位置、大小和阅码框架均... 采用RT-PCR技术扩增禽呼肠孤病毒ARV S1133毒株和广西分离株R1的σ2基因,将σ2基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)载体上,对获得的重组质粒经PCR酶切以及序列分析鉴定。结果表明,插入的片段为σ2目的基因,插入的位置、大小和阅码框架均正确,成功构建了真核表达载体重组质粒pcDNA-S1133-σ2、pcDNA-R1-σ2;分别免疫SPF鸡2次后,用ARV S1133进行攻毒,使用RT-PCR方法进行检测,结果表明,pcDNA-S1133-σ2、pcDNA-R1-σ2 DNA疫苗免疫组检出率与对照组差异显著(p<0.05),与灭活苗免疫组及σ2蛋白免疫组差异不显著(p>0.05)。使用ARVσ2基因构建的真核表达质粒来免疫SPF鸡,鸡只获得了较好的免疫保护作用。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 σ2基因 pcdna3.1(+) 免疫保护
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