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抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1RNA干扰系统的构建 被引量：3
1
作者 蒋觉安 董万利 +2 位作者 胡锦 王元元 惠国桢 《江苏医药》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期333-336,共4页
目的构建抑制血管内皮生长因子(VEGF)活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPERH1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPERH1质粒PolⅢH1启动子下游,... 目的构建抑制血管内皮生长因子(VEGF)活性的小干扰RNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPERH1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPERH1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPERH1VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致。结论重组pSUPERH1VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。 展开更多
关键词 psuper质粒 RNA干扰 小干扰RNA 短发夹RNA 血管内皮生长因子
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RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究 被引量：1
2
作者 张立智 蔡宣松 +3 位作者 钱志康 周家钤 袁峰 黄伟达 《同济大学学报（医学版）》 CAS 2006年第1期13-16,20,共5页
目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建pSuper质粒,化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸,克隆进pSuper的pol IIIH I启动子的下游,重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒,并转染入骨肉瘤MG63细... 目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建pSuper质粒,化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸,克隆进pSuper的pol IIIH I启动子的下游,重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒,并转染入骨肉瘤MG63细胞,W estern b lot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化。结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序,证实成功构建了KDR siRNA表达质粒,转染入细胞后,有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达。结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达,为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础。 展开更多
关键词 骨肉瘤 RNAI KDR MG63 psuper质粒 蛋白表达
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抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建 被引量：1
3
作者 蒋觉安 董万利 +2 位作者 胡锦 王元元 惠国桢 《苏州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第3期349-353,共5页
目的构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPE... 目的构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢH1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢH1启动子下游,获得重组pSUPER-H1质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,表明序列完全一致。结论重组pSUPER-H1载体的成功构建,为进一步研究神经生长因子活性打下基础,同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。 展开更多
关键词 psuper质粒 RNA干扰 小干扰RNA 短发央RNA 神经生长因子
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人鞘磷脂合酶干扰载体的构建与鉴定 被引量：1
4
作者 胡时栋 丁毅 +2 位作者 宋丹丹 陈清兰 颜念龙 《复旦学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期584-588,共5页
目的构建沉默人鞘磷脂合酶1(SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础。方法根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA(shRNA... 目的构建沉默人鞘磷脂合酶1(SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础。方法根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成用于构建人SMS沉默载体的DNA寡核苷酸,应用基因重组技术分别和线性化pSUPER干扰载体连接,构建了pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2重组干扰载体,并用EcoRI和HindIII限制性内切酶同时处理重组载体pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2,随后测序,以鉴定重组干扰载体含有目的序列。同时为检测重组干扰载体对人SMS1和SMS2基因的干扰效率,本研究利用脂质体(Lipofectamine 2000)分别转染肝癌细胞HepG2,于48h后分别检测HepG2细胞SMS1和SMS2mRNA的转录水平与SMS酶活(薄层层析法,TLC)。结果所筛选到的重组质粒pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后获得了281bp DNA片段,且测序结果和理论设计的DNA寡核苷酸一致;随后检测转染HepG2细胞后SMS1和SMS2的mRNA表达水平。实验结果显示SMS1和SMS2的表达分别下降了45%和67%(P<0.001,n=3),而TLC法的酶活结果检测显示,SMS1和SMS2干扰后的SMS酶活均有显著下降,分别下降了56%和63%(P<0.001,n=3)。结论成功构建了人SMS1以及SMS2基因的沉默载体即pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2。 展开更多
关键词 鞘磷脂合酶 psuper干扰质粒 HEPG2细胞
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