利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物 被引量：10

1

作者 刘慧娟 冯志国 何光源 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期38-39,共2页

目的:制备一套DNA分子量标准物。方法:利用多聚酶链式反应技术(PCR),以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。... 目的:制备一套DNA分子量标准物。方法:利用多聚酶链式反应技术(PCR),以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。结果:DNA分子量条带大小依次为1653bp、1173bp、691bp、606bp、496bp、401bp、326bp、238bp、155bp,条带分布适度、亮度清晰。结论:制备了能满足研究和实验室的要求DNA分子量标准物,和市售的相比,成本大大降低。 展开更多

关键词 多聚酶链式反应 pmd18-T载体 DNA分子量标准物

下载PDF 职称材料

牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆 被引量：4

2

作者 潘志明 孙辉 王运吉 《大连轻工业学院学报》 2005年第2期106-109,共4页

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovI... 根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。 展开更多

关键词 大肠杆菌 Γ-干扰素基因 克隆 IFN-γ 聚合酶链式反应 限制性酶切分析 脾脏淋巴细胞 PCR产物 序列设计 cDNA 总RNA 基因序列 表达载体 基因片段 逆转录 一步法 特异性 T载体 引物 测序

下载PDF 职称材料

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定 被引量：3

3

作者 吴德铭 罗满林 +2 位作者 黄毓茂 刘镇明 邬苏晓 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期71-73,共3页

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和... 以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株 (PRVYA)的基因组为模板 ,利用聚合酶链反应 (PCR)扩增TK基因 ,获得预定大小的片段 ,将这一片段克隆到PMD18-T载体中 .对重组质粒PMD18-TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较 ,证实了克隆片段的可靠性 . 展开更多

关键词 伪狂犬病毒 粤A毒株 TK基因 扩增 克隆 序列测定 聚合酶链反应 pmd18-T载体

下载PDF 职称材料

利用接头插入技术构建环型T载体(pYCQ1) 被引量：1

4

作者 杨成泉 马春泉 +2 位作者 杨达梅 蒋丹 李海英 《黑龙江大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第1期117-120,共4页

人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实... 人工设计接头序列,其特点为含有3′突出A末端,同时人工接头序列内部含有XcmⅠ、BspM901、AceⅡ酶切位点。利用人工接头3′突出A与线性的pMD18-T载体的3′突出T连接,将线性的pMD18-T载体改造成环形具有自身复制功能的pYCQ1载体,降低了实验室使用T载体的成本,同时增加了载体的克隆位点。利用pYCQ1作为T载体时,用XcmⅠ酶切(XcmⅠ限制性片段具有3′T末端)pYCQ1载体可以得到线性的3′T粘性末端的pYCQ1-T载体。实验验证,pYCQ1-T载体可以在受体菌E.coliDH5α中进行大量自我复制,并能够克隆1 800 bp的外源PCR产物。 展开更多

关键词 接头 XcmⅠ pmd18-T载体 pYCQ1载体 pYCQ1-T载体

下载PDF 职称材料

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建 被引量：2

5

作者 吴德铭 黄毓茂 +2 位作者 罗满林 刘镇明 邬苏晓 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期69-72,共4页

根据伪狂犬病毒(PRV)NIA 3和Rice株的gE基因序列,设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的引物,以PRV粤A毒株(PRV YA)基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段,将这一片段克隆至PMD18 T载体中,获得重组质粒PMD... 根据伪狂犬病毒(PRV)NIA 3和Rice株的gE基因序列,设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BamHⅠ酶切位点的引物,以PRV粤A毒株(PRV YA)基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段,将这一片段克隆至PMD18 T载体中,获得重组质粒PMD18 gE;用HindⅢ和BamHⅠ酶切该重组质粒,回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因,将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3 1(+)真核表达载体中,获得真核表达重组质粒pcDNA3 1 gE,经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较,证实了克隆片段的可靠性. 展开更多

关键词 猪 伪狂犬病毒粤A株 GE基因 真核表达 质粒构建 BarnHI酶切位点 序列测定

下载PDF 职称材料

荧光标记DNA分子量内标的设计与制备 被引量：1

6

作者 杨翩 王邦义 +2 位作者 叶健 梁景青 赵兴春 《生命科学仪器》 2014年第6期56-58,共3页

目的:设计并制备65bp-500bp范围的荧光标记DNA分子量内标。方法:p MD18-T Vector连接任意一段割胶回收的DNA片段,克隆后提取重组质粒经双酶切后作为模板,在其上游设计一条固定引物并用荧光标记,在其下游设计一系列引物,经PCR扩增后在ABI... 目的:设计并制备65bp-500bp范围的荧光标记DNA分子量内标。方法:p MD18-T Vector连接任意一段割胶回收的DNA片段,克隆后提取重组质粒经双酶切后作为模板,在其上游设计一条固定引物并用荧光标记,在其下游设计一系列引物,经PCR扩增后在ABI 3100遗传分析仪上检测。结果:扩增产物DNA片段大小分别为65bp、105bp、149bp、200bp、241bp、269bp、311bp、345bp、400bp、450bp、500bp,与预期片段大小一致。结论:11个片段经混合调平后,峰型良好,出峰位置均匀,可用于毛细管电泳中DNA片段大小的确定。 展开更多

关键词 荧光标记 pmd-18T vector PCR 分子量内标

下载PDF 职称材料

基于Eam1105Ⅰ酶切的p18K-T载体的构建

7

作者 周天顺 余东 +6 位作者 董皓 孙志忠 孙学武 谭炎宁 盛夏冰 段美娟 袁定阳 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期3579-3584,共6页

TA克隆是PCR产物克隆最简单的方法,而T载体的改良对提高TA克隆效率、简化克隆片段后续的酶切、连接等实验步骤有着十分重要的意义。本研究以pMD18-T载体为基础,将原有的氨苄青霉素抗性筛选标记基因替换成卡那霉素抗性筛选标记基因,克服... TA克隆是PCR产物克隆最简单的方法,而T载体的改良对提高TA克隆效率、简化克隆片段后续的酶切、连接等实验步骤有着十分重要的意义。本研究以pMD18-T载体为基础,将原有的氨苄青霉素抗性筛选标记基因替换成卡那霉素抗性筛选标记基因,克服了原载体筛选抗性(氨苄青霉素)容易失活的问题,并在原有酶切位点的基础上增加了NsiⅠ、BsaⅠ、BglⅡ、NheⅠ和AclⅠ五个酶切位点,方便了克隆片段后续的酶切和连接操作,同时在XbaⅠ和BglⅡ之间引入了两个Eam1105I限制性核酸内切酶位点,构建成一个环状中间载体p18KT-M。利用Eam1105I酶切中间载体p18KT-M可以制备3’端带有T尾的线性化p18K-T载体。经TA克隆验证,p18K-T载体连接PCR产物的效率与原pMD18-T载体的效率相当。 展开更多

关键词 TA克隆 pmd18-T载体 p18K-T载体 Eam1105Ⅰ限制性核酸内切酶

原文传递

弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒的构建

8

作者 贾雪梅 李飞 +2 位作者 王红 曾瑾 李翠英 《昆明医学院学报》 2006年第4期11-15,共5页

目的构建弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.方法从接种了弓形虫三种不同毒株RH株、桂弓株、B36株的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA.应用PCR技术,分别扩增出三个不同虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段.将此目的基... 目的构建弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.方法从接种了弓形虫三种不同毒株RH株、桂弓株、B36株的小鼠腹水中收集、纯化虫体,提取基因组DNA.应用PCR技术,分别扩增出三个不同虫株的致密颗粒蛋白1(GRA1)目的基因片段.将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性.结果获得弓形虫三种不同毒株GRA1目的基因片段为785 bp.构建了pMD-18-T/GRA1重组质粒,经鉴定与预期理论值相符.结论成功构建了弓形虫三种不同毒株pMD-18-T/GRA1重组质粒.进行弓形虫不同毒株的GRA1基因测序,为研究其同源性及进一步应用研究创造了条件. 展开更多

关键词 弓形虫 不同毒株 致密颗粒蛋白1(GRAI) pmd-18-T vector 重组质粒

下载PDF 职称材料

pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的研究

9

作者 吴景华 王海欣 《中国妇幼保健》 CAS 北大核心 2010年第28期4119-4120,共2页

目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把... 目的:利用RT-PCR法从A组轮状病毒扩增基因片段VP7,再将产物重组于大肠杆菌pMD18-T载体,探讨pMD18-T作为A组轮状病毒VP7基因克隆载体的应用。方法:提取A组轮状病毒总RNA,通过RT-PCR扩增,获得目的基因片段VP7,进行分离纯化和回收,最后把纯化的VP7基因与pMD18-T载体进行连接,进行质粒抽提与鉴定。结果:成功将VP7基因连接到pMD18-T载体,转化感受态菌(DH5α),通过蓝白斑筛选得到DNA阳性重组子(载体+VP7基因片段),经DNA测序鉴定正确。结论:成构建功A组轮状病毒外壳蛋白VP7基因克隆载体,为进一步获得大量VP7基因以及研究和开发轮状病毒基因工程疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 A组轮状病毒 VP7 RT-PCR pmd18-T载体

原文传递

翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建 被引量：8

10

作者 仲崇斌 刘长江 +2 位作者 费腾 袁晓东 孙丽慧 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期80-83,共4页

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进... 从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RT- PCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定。 展开更多

关键词 胆碱单加氧酶 pmd18-T-simple载体 pBI121植物表达载体 大肠杆菌 JM109

下载PDF 职称材料

HP450基因的克隆及其重组载体pMD18-HP450的构建与鉴定

11

作者 陈海英 王乃平 韦锦斌 《医学综述》 2007年第1期79-80,共2页

目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示... 目的构建HP450基因的克隆载体。方法用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克隆HP450基因,T-A连接到pMD18-T载体。以菌液为模板做PCR、酶切和测序鉴定pMD18-HP450重组质粒载体。结果菌液PCR扩增出目的条带、重组体的酶切产物合理,测序显示目的基因与基因库中的H1基因100%同源。结论实现了HP450基因的克隆及其重组质粒载体pMD18-HP450的构建。 展开更多

关键词 HP450基因 克隆 质粒载体 pmd18-HP450 肝肿瘤 基因疗法

下载PDF 职称材料

人BMP4基因的克隆及其原核表达载体的构建

12

作者 刘秋英 陈伟 +4 位作者 毛国梁 熊盛 钱垂文 利奕成 王一飞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期90-92,共3页

以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重... 以成熟人胎盘组织为材料来源,克隆人BMP-4基因的全长cDNA,经过PCR扩增后与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T-BMP4克隆质粒。酶切后回收小片段与表达载体pET-22b的多克隆酶切位点连接,构建原核表达载体pET22b-BMP4,酶切及测序鉴定重组子。重组质粒转化至感受态的Rosseta宿主菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,从胎盘组织中成功地克隆到人BMP4基因,与NCBI中公布的序列100%相符合,原核表达载体pET22b-BMP4转化至Rosseta构建表达菌体,经IPTG诱导后电泳分析可见重组蛋白表达的条带。 展开更多

关键词 骨形成蛋白4 基因克隆 原核表达 pmd18-T载体 pET-22b载体

下载PDF 职称材料