非洲猪瘟病毒主要抗原p54-1的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定 被引量：20

1

作者 王彩霞 冯春燕 +4 位作者 杜方原 刘丹丹 张永宁 林祥梅 吴绍强 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第10期2823-2830,共8页

为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列(登录号:NC_001659.2)设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核... 为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白的主要抗原表位及抗原性质,本试验根据GenBank中p54基因序列(登录号:NC_001659.2)设计表达区域特异性引物,PCR扩增后连接表达载体pGEX6p-1构建pGEX6p-1-p54-1原核表达质粒;将该质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,切除GST标签后采用阴离子柱纯化目的蛋白并鉴定;将纯化蛋白与佐剂混合乳化后作为免疫原,免疫小鼠制备p54-1蛋白多克隆抗体;采用ELISA和Western blotting检测抗体的效价和反应特性。结果显示,重组p54-1融合蛋白以可溶形式表达,切除标签后的纯化蛋白能够与ASFV阳性血清发生反应,而与PRRSV和PCV3不发生反应。利用该蛋白免疫获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128 000。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体能够识别ASFV p54蛋白。表明本研究成功获得了较高纯度的p54-1蛋白,制备的p54-1多克隆抗体具有较高反应性和特异性,为后续非洲猪瘟双抗夹心ELISA检测方法的建立提供依据。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p54蛋白 原核表达 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒P54蛋白的真核表达及间接ELISA检测方法的建立 被引量：16

2

作者 梁云浩 曹琛福 +2 位作者 陶虹 吕建强 唐勇 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期373-378,共6页

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出非洲猪瘟病毒P54蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot分析后,以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,通过优化各反应条件,建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,P54重组蛋白的大小约为25... 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出非洲猪瘟病毒P54蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot分析后,以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,通过优化各反应条件,建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,P54重组蛋白的大小约为25ku;经Western-blot试验证实,它具有良好的抗原性。建立的间接ELISA方法的检测灵敏度可达1∶320,批内、批间变异系数均小于10%。与商品化的非洲猪瘟竞争ELISA试剂盒比较,符合率达100%。用该间接ELISA方法检测其他不同疫病猪的阳性血清样本,结果均为阴性,表明无交叉反应。结果表明,建立的用以检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA方法具有敏感性高、重复性好、特异性好的特点。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 重组杆状病毒 间接ELISA

原文传递

非洲猪瘟病毒p54蛋白的高效表达及在ELISA中的应用 被引量：11

3

作者 龚振华 王丽萍 +9 位作者 臧京帅 张康 刘春菊 吴晓东 张启迪 秦晓冰 陈琳琳 单虎 王树双 王志亮 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1832-1837,共6页

本研究旨在高效原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白,并进一步将其用于ELISA试验研究。参考非洲猪瘟病毒Con09/Bzz020株P54基因(E183L)的核苷酸序列,通过序列优化后合成P54基因,克隆至表达载体pET-30c(+),构建重组质粒pET-30c(+)-p54。... 本研究旨在高效原核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白,并进一步将其用于ELISA试验研究。参考非洲猪瘟病毒Con09/Bzz020株P54基因(E183L)的核苷酸序列,通过序列优化后合成P54基因,克隆至表达载体pET-30c(+),构建重组质粒pET-30c(+)-p54。结果显示,pET-30c(+)-p54有完整的阅读框架,可高效表达分子量约20.7ku的p54蛋白,该蛋白表达稳定,具有可溶性,易于纯化,纯度高达900μg·mL-1,所表达的p54蛋白的氨基酸序列与Con09/Bzz020株p54蛋白氨基酸序列相同;Western blot试验显示,表达的p54蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性反应;ELISA试验显示,p54蛋白针对ASFV阳性血清和阴性血清的P/N值为4.67。研究结果证实p54蛋白表达产量高,易于纯化,具有较好的抗原性,可用于非洲猪瘟ELISA诊断。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 ELISA

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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：5

4

作者 齐艳丽 刘桃雪 +5 位作者 于海深 张超 鲁维飞 王江 褚贝贝 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期281-292,共12页

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4... 旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 原核表达 单克隆抗体 间接ELISA 抗原表位

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非洲猪瘟病毒p54蛋白抗原表位预测及鉴定 被引量：9

5

作者 曹琛福 梁云浩 +7 位作者 花群俊 吕建强 孙洁 廖立珊 唐金明 张彩虹 杨俊兴 张桂红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期848-851,共4页

为鉴定非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的B细胞线性抗原表位,本研究利用生物信息学方法结合抗原指数对ASFV p54蛋白进行抗原表位的预测,人工合成预测的抗原表位多肽,利用ASFV阳性血清以及特异性单克隆抗体(MAb),采用间接ELISA和阻断ELISA方... 为鉴定非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的B细胞线性抗原表位,本研究利用生物信息学方法结合抗原指数对ASFV p54蛋白进行抗原表位的预测,人工合成预测的抗原表位多肽,利用ASFV阳性血清以及特异性单克隆抗体(MAb),采用间接ELISA和阻断ELISA方法验证所预测抗原表位多肽的免疫学特性。预测结果显示,可能的抗原表位区域有:aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa124-aa130,aa137-aa150。间接ELISA试验表明aa23-aa29,aa36-aa45,aa72-aa94,aa114-aa120,aa137-aa150多肽的抗原性较好,其中aa36-aa45,aa72-aa94多肽可以分别与两株杂交瘤细胞分泌的MAb发生特异性反应,本研究为ASF多肽疫苗及免疫学临床诊断方法的建立奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 p54蛋白 抗原表位

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非洲猪瘟病毒p54蛋白的表达及单抗制备 被引量：7

6

作者 冯春燕 宋晓晖 +6 位作者 仇松寅 王淑娟 王彩霞 张永宁 邓俊花 吴绍强 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2016年第5期80-84,共5页

为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋... 为制备非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体,本研究扩增p54蛋白的胞外区编码基因,分别克隆到p ET30a和p GEX-6p-1中,构建了p54-p ET30a和p54-p GEX-6p-1重组质粒;将质粒分别转化到大肠杆菌BL21中,表达C末端带6个His、N端带有GST的p54重组蛋白;利用亲和层析的方法,富集和纯化带His标签的p54蛋白;以带His标签的p54蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备单克隆抗体;以带有GST标签的p54蛋白为抗原,对制备的单抗进行特异性验证。结果显示:大肠杆菌能高效表达带His标签和GST标签的非洲猪瘟p54蛋白;His标签的p54蛋白免疫BALB/C小鼠后,得到了3株单克隆抗体;Western blot结果表明,3株单克隆抗体能与带有GST标签的p54蛋白相互反应。本研究成功制备了p54的单克隆抗体,为进一步开展非洲猪瘟ELISA、Western blot和细胞免疫荧光检测技术的开发研究奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 体外表达 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒p54蛋白原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：3

7

作者 赵改红 张涛清 +3 位作者 向志达 张元峰 李江南 翁长江 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第1期166-173,共8页

本研究以ASFV Pig/HLJ/18分离株基因组DNA为模板扩增tE183L基因片段,构建重组原核表达质粒pET-21a-tE183L。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达可溶性p54蛋白,并将采用镍亲和层析柱和分子筛纯化的p54与弗氏佐剂等比混合后免... 本研究以ASFV Pig/HLJ/18分离株基因组DNA为模板扩增tE183L基因片段,构建重组原核表达质粒pET-21a-tE183L。将其转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导表达可溶性p54蛋白,并将采用镍亲和层析柱和分子筛纯化的p54与弗氏佐剂等比混合后免疫新西兰大白兔,采集血清经Protein G亲和层析纯化得到兔抗p54多克隆抗体。研究结果表明,构建的原核表达质粒p ET-21a-t E183L可成功表达p54蛋白且纯度较高。Western blot、间接免疫荧光和免疫沉淀试验结果显示,纯化的抗p54多克隆抗体能特异性识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-ASFV p54蛋白和ASFV感染肺泡巨噬细胞(PAMs)后表达的ASFV p54蛋白。本研究成功表达和纯化p54可溶性蛋白;制备的多克隆抗体有良好的特异性,这为深入探讨ASFV p54蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的原核表达与反应原性鉴定 被引量：6

8

作者 官丽娟 邵钰 +7 位作者 任伟杰 宫枫举 韩同福 邹艳丽 孙学强 吴晓东 张志 黄保续 《中国动物检疫》 CAS 2019年第12期63-67,共5页

p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表... p54蛋白为非洲猪瘟病毒(ASFV)的主要结构蛋白之一,参与病毒对靶细胞的吸附与进入。为深入研究p54结构蛋白的抗原性,根据GenBank序列号(MK128995)对应的E183L基因序列,设计1对特异性引物扩增其整个CDS区,并克隆至pET-30a(+)载体,构建了表达p54蛋白的重组质粒pET-30a(+)-p54。用BL21(DE3)转化该质粒,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳,可见重组质粒表达出1条分子量约为20 kDa的特异性条带,且重组表达蛋白以融合表达蛋白形式存在于上清。进一步通过His亲和层析法纯化目的蛋白,用ASFV阳性血清进行蛋白质免疫印迹反应,发现表达的重组p54蛋白能与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明p54蛋白表达成功。本研究为ASFV抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 结构蛋白 p54蛋白 表达

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非洲猪瘟病毒p54间接ELISA抗体检测方法的建立及试剂盒研制

9

作者 岳慧贤 李其炫 +8 位作者 惠丽丽 赵心馨 陈腾 张艳艳 王述超 缪发明 张菲 张守峰 扈荣良 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期907-913,共7页

非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了A... 非洲猪瘟是对全球养猪业危害最严重的病毒性传染病,目前尚无有效疫苗。p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要结构蛋白之一,参与病毒的吸附和侵入,是非洲猪瘟血清学诊断的重要靶标之一。本研究采用无标签的重组p54蛋白作为包被抗原,建立了ASFV p54间接ELISA抗体检测方法,优化了检测条件,组装成了试剂盒。根据对374份阴性猪血清的检测,确定了本试剂盒检测的临界值,并利用不同猪病原阳性质控血清进行了敏感性、特异性和稳定性研究。结果显示,本方法检测阴/阳性血清的临界值为0.250;敏感性血清质控品的最小检出限为1∶1 600倍,与ASFV阳性血清、猪伪狂犬病病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸病毒综合征病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、猪细小病毒阳性血清和猪抗大肠杆菌阳性血清等6种特异性质控血清均无交叉反应;试制的3批试剂盒批间和批内变异系数均小于10%。试剂盒在2~8℃贮存9个月,特异性、敏感性保持不变。以上试验结果表明,本试剂盒具有良好的敏感性、特异性和稳定性,与OIE推荐的p72阻断ELISA抗体检测试剂盒具有较高符合率,为非洲猪瘟临床血清学诊断和抗体监测提供了良好的技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 间接ELISA 试剂盒

原文传递

非洲猪瘟病毒p54蛋白单抗制备及B细胞线性抗原表位鉴定

10

作者 陈艳 龙云凤 +1 位作者 姜焱 周斌 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第1期115-122,共8页

以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,... 以原核系统表达的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白为免疫原接种BALB/c小鼠,经过细胞融合、间接ELISA筛选和多次亚克隆获得了3株能够稳定分泌抗p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为2A4、5F6和RH15。3株单克隆抗体的重链均属于IgG1亚类,轻链均为Kappa型。Western blot和免疫荧光试验(IFA)证明3株单克隆抗体具有良好的反应性,可以用于靶抗原的特异性检测。通过噬菌体展示肽库筛选,确定了单克隆抗体2A4、5F6识别的抗原表位为^(157)NTASQ^(161),RH15识别的抗原表位为^(170)RQRNTYTHKDL^(180),进一步完善了靶抗原的B细胞线性抗原表位信息。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的功能研究进展 被引量：1

11

作者 李子萱 张永红 +1 位作者 童津津 崔德凤 《动物医学进展》 北大核心 2023年第8期72-75,共4页

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性出血性猪传染病,自2018年传入我国以来,使我国生猪养殖业规模急剧减少,并对社会经济造成了巨大影响。由于非洲猪瘟病毒过于复杂,使疫病防治成为难点,目前尚无有效防控疫苗及治疗药物,其中由E183... 非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性出血性猪传染病,自2018年传入我国以来,使我国生猪养殖业规模急剧减少,并对社会经济造成了巨大影响。由于非洲猪瘟病毒过于复杂,使疫病防治成为难点,目前尚无有效防控疫苗及治疗药物,其中由E183L基因编码的p54蛋白参与病毒组装、诱导细胞凋亡及中和抗体等过程,并且是血清学检测诊断技术与疫苗免疫研究方面的重要靶点之一,此外,p54基因型可作为辅助指标,对追踪病毒演变过程有着重要意义。因此,通过分析p54蛋白在非洲猪瘟病毒感染过程中的作用,为阐明非洲猪瘟病毒致病机制、探索非洲猪瘟疫病防控方法及疫苗研发等方面提供参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 疫苗 生物学功能

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非洲猪瘟病毒截短p54蛋白的原核表达与纯化 被引量：1

12

作者 伦玉潇 李桂梅 单虎 《动物医学进展》 北大核心 2023年第2期1-7,共7页

旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFV p54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及... 旨在高效表达可溶性的非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白。去除可能影响p54蛋白可溶性表达的前50个氨基酸(aa),根据GenBank收录的ASFV p54基因序列设计引物,从第51个aa对应的基因序列起用PCR扩增截短的p54基因,并用分子克隆方法插入到带有TF及His标签的冷休克表达载体pCold TF上,构建pCold TF-p54重组质粒。经菌液PCR及测序验证后将重组质粒转化到BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达p54重组截短蛋白,对IPTG诱导浓度、诱导时间进行优化,并对纯化重组蛋白时所用洗脱液的咪唑浓度进行探索。Western blot鉴定p54重组截短蛋白的反应原性,并探究TF标签对于该蛋白反应原性的影响。结果表明,成功构建了pCold TF-p54重组质粒,经终浓度为1 mmol/L的IPTG于16℃诱导9 h时,p54重组截短蛋白的表达量最高,分子质量约为76 ku。经50 mmol/L咪唑洗脱液洗脱可得到较纯的p54重组截短蛋白,经人鼻病毒(Human rhinovirus,HRV)3C Protease切除TF及His标签后,再次纯化可得到无标签且高纯度的p54截短蛋白。Western blot结果显示无标签的p54截短蛋白及有标签的p54重组截短蛋白均可被ASFV p54单克隆抗体特异性识别,均具有反应原性,且p54重组截短蛋白还可被ASFV阳性血清特异性识别。研究证实了原核表达的p54重组截短蛋白兼具可溶性、良好的反应原性,且重组蛋白上的TF标签不影响抗体对p54蛋白的识别,因此可用于后续ASFV抗体检测方法的研发。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 pCold TF载体 原核表达 纯化

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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立 被引量：4

13

作者 徐玲玉 曹琛福 +4 位作者 李中圣 陈俊宏 柳腾飞 王新凯 贾伟新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期813-821,共9页

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性... 旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法。采用原核表达的ASFV p54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价。结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0μg·mL^(-1),抗原包被温度及时间为4℃过夜,被检血清稀释度为1∶40,酶标单抗稀释度为1∶1000,被检血清作用时间为1 h,酶标单抗作用时间为30 min,底物作用时间为10 min。经阴、阳性样品检测和特异性、敏感性试验,当临界值阻断率≥55.2%时,判定为阳性,当阻断率<43.4%时,判定为阴性,介于两者之间判定为可疑。该方法与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、猪流感病毒、猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应,特异性好。批内重复试验及批间重复试验的变异系数(CV)均在10%以内。将该方法进行初步应用,并与商品化ELISA试剂盒进行符合性试验,两者的检测符合率为98%。综上表明,建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于ASFV临床样品的抗体检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 ASFV 阻断ELISA p54蛋白 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

14

作者 程茵 费定润 +7 位作者 于莹 刘怡炜 章先 王晓杜 孙静 宋厚辉 吴芹 程昌勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期750-754,768,共6页

p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白,参与病毒的早期感染,具有较强的免疫原性,常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原... p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白,参与病毒的早期感染,具有较强的免疫原性,常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54),采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示,rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带,经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠,三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫,3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示,三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000,表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示,获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性,采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示,3株MAb均在17 ku处出现特异性条带;IFA结果显示,以3株MAb作为一抗的表达p54蛋白的HEK293T细胞出现绿色荧光,而未转染质粒的阴性对照细胞无绿色荧光;间接ELISA结果显示,3株MAb仅与p54蛋白反应,而与其它猪源病毒蛋白均无反应。上述结果表明,本研究获得具有良好免疫原性的rp54,并制备了3株p54 MAb,且3株MAb的反应原性及特异性均较强,本研究为开发ASFV的检测技术和开展该病毒的生物学研究提供了生物材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 单克隆抗体 检测技术

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非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

15

作者 敖清莹 钟秋萍 +7 位作者 史馨瑾 魏常青 刘英楠 廖欣欣 谢振华 钱莺娟 郑龙三 陈鸿军 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第4期164-169,共6页

非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的... 非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 昆虫细胞表达系统 免疫原性

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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：4

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作者 郑丁丁 逄文强 +12 位作者 王衡 孙哲 黄甜 王彦伟 郝丽影 曹红梅 李雪锋 周莹 白晨雨 陈凌燕 邓均华 张桂红 田克恭 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1143-1150,共8页

2018年8月我国发现非洲猪瘟(African swine fever,ASF),并在多地蔓延,由于尚无疫苗和有效的治疗方法,病死率高达100%,给养猪业带来巨大的损失。目前控制该病,主要依靠快速、准确的诊断方法,尽早发现、处理,防止扩散。为制备特异性的非... 2018年8月我国发现非洲猪瘟(African swine fever,ASF),并在多地蔓延,由于尚无疫苗和有效的治疗方法,病死率高达100%,给养猪业带来巨大的损失。目前控制该病,主要依靠快速、准确的诊断方法,尽早发现、处理,防止扩散。为制备特异性的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54蛋白单克隆抗体,本研究利用大肠杆菌表达ASFV p54蛋白C端胞内区片段,构建能表达ASFV p54蛋白的工程菌E.coli BL21/pET-p54,经IPTG诱导表达可溶性的p54蛋白。用纯化后的可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经4次筛选和3次亚克隆获得了21株分泌ASFV p54蛋白单克隆抗体的细胞株。通过ELISA测定腹水效价,结果均在1︰40000~1︰5120000范围之内。以免疫组织化学染色法鉴定单克隆抗体,结果有9株可以特异性检出ASFV抗原。对免疫组化阳性的单克隆抗体进行亚类鉴定,结果5株为IgG1,4株为IgG2a。以免疫印迹试验(Western Blot)和间接免疫荧光法(Indirect immunoinfluscent assay,IFA)鉴定单克隆抗体的特异性,结果显示,所有单克隆抗体均与p54蛋白和ASFV抗原反应,而不与表达载体及猪源其他常见病毒反应。本研究获得的单克隆抗体,将为ASFV的疫苗及诊断技术研究奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p54蛋白 单克隆抗体

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基于非洲猪瘟病毒p30与p54蛋白表位串联多肽的间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：2

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作者 马俊 王志远 +4 位作者 梁杏玲 郑泽中 杨汉春 张桂红 王衡 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4325-4336,共12页

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原... 旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的间接ELISA方法。本研究以两株纯化的ASFV p30与p54蛋白单克隆抗体(mAbs)为靶分子,利用噬菌体展示十二肽库进行四轮生物淘选,筛选多肽表位,以氨基酸GGG为接头设计合成表位串联多肽作为包被抗原,通过棋盘滴定法确定间接ELISA的最佳反应条件,利用不同类型血清样本对建立的方法进行特异性分析、敏感度分析、稳定性分析及符合性评价。噬菌体淘选试验结果表明^(146) PAEPYTT ^(152)为本实验室保存的mAb所识别的p54蛋白抗原表位核心序列。ELISA条件优化试验结果显示,以鸡卵白蛋白(OVA)作为N端偶联物的表位串联多肽抗原具有较低的非特异性血清反应背景,当多肽以碳酸盐缓冲液包被(2μg·mL^(-1)),血清以封闭液(1%明胶溶液)稀释100倍,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体以0.05%PBST溶液稀释5000倍时,反应效果最佳;以上述优化后的条件确定了血清抗体阳性临界值为0.339。方法评价试验结果显示,该方法与经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)的抗体阳性血清均无交叉反应,能检测低至1600倍稀释的ASFV阳性血清,具有较好的重复性。用该方法与商品化的ASFV抗体检测试剂盒同时检测320份猪血清样本,两种方法的相对特异性和相对敏感性分别为97.6%与97.3%,总体符合率达97.5%(312/320)。综上表明,本研究建立的多肽间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性,具有发展为临床诊断试剂盒的潜在应用价值。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 p54蛋白 生物淘选 表位串联多肽 间接ELISA

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PAK4与P54蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义 被引量：2

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作者 张鹏 朱静 +2 位作者 吕晓兰 张兴旺 崔波 《陕西医学杂志》 CAS 2017年第11期1604-1606,共3页

目的:研究p21-activated kinase(pAK)-4和P54蛋白在乳腺癌中的表达和相互作用。方法:选择乳腺癌癌旁正常组织、乳腺纤维瘤、乳腺癌和乳腺癌转移瘤组织各20例,用免疫组织化学S-P法检测pAK-4表达,比较其与不同病理特征的关系。用免疫荧光... 目的:研究p21-activated kinase(pAK)-4和P54蛋白在乳腺癌中的表达和相互作用。方法:选择乳腺癌癌旁正常组织、乳腺纤维瘤、乳腺癌和乳腺癌转移瘤组织各20例,用免疫组织化学S-P法检测pAK-4表达,比较其与不同病理特征的关系。用免疫荧光法体外观察P54亚细胞定位及与PAK4的共定位情况。结果:乳腺癌癌旁正常组织、乳腺纤维瘤、乳腺癌转移瘤组织和乳腺癌中PAK4表达阳性率逐渐增加,阳性产物主要位于胞浆,尤以核周明显,细胞基质未见明显染色,差异有统计学意义(P<0.05)。非浸润性癌、早期浸润癌、晚期浸润癌中PAK4表达阳性率逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05)。通过共聚焦实验证实P54定位在细胞浆,且和PAK4有共定位。结论:PAK4和P54蛋白可能作为诊断和治疗乳腺癌的重要敏感分子标志物。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤/病理学 pAK4蛋白 p54蛋白 免疫组织化学

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稳定表达非洲猪瘟病毒P54蛋白的Vero细胞系的建立 被引量：1

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作者 王彩霞 杜方原 +4 位作者 林祥梅 Grzegorz Wozniakowski 王勤 冯春燕 吴绍强 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期139-144,共6页

旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293... 旨为建立稳定表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P54蛋白的Vero细胞系,将ASFV-P54基因与绿色荧光基因Azami Green的融合基因片段,将其克隆至慢病毒载体pLV-puro中构建重组慢病毒质粒pLV-ASFV-P54-AG,将该质粒与慢病毒包装质粒pH1和pH2共转染HEK-293V细胞,包装表达ASFV-P54蛋白的慢病毒。将重组慢病毒在聚凝胺(Polybrene)的介导下感染Vero细胞,筛选出一株稳定表达ASFV-P54蛋白的Vero细胞系,命名为Vero-AG-ASFV-P54。间接免疫荧光试验表明,该细胞系能够与P54多克隆抗体反应;经波兰国家兽医研究所进一步验证,结果显示,该细胞系与ASFV抗体阳性血清也能发生反应,并且与阴性血清无反应。结果表明,Vero-AG-ASFV-P54细胞系能够稳定高效的表达具有生物活性的ASFV-P54蛋白。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 Azami绿色荧光蛋白 VERO细胞 慢病毒载体

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非洲猪瘟病毒p54蛋白的截短表达及其单克隆抗体的制备

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作者 郑南南 东梦珂 +6 位作者 吴宏举 侯浩宇 陈寅龙 李潮 赵慧君 张改平 杜永坤 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期2139-2144,共6页

非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞... 非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 原核表达 单克隆抗体

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