非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：9

1

作者 张路捷 高雁怩 +2 位作者 夏婷婷 白娟 姜平 《畜牧与兽医》 北大核心 2021年第6期111-115,共5页

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的... 为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。2株杂交瘤细胞从第10代开始均能稳定分泌抗体,细胞上清抗体效价均为1∶6400。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞发生特异性反应。试验结果为p30蛋白生物学和诊断方法研究提供了技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的制备与应用 被引量：9

2

作者 郝丽影 王彦伟 +6 位作者 孙玉洁 曹红梅 黄甜 逄文强 李向东 邓均华 田克恭 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期124-129,共6页

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫学诊断试剂,利用大肠杆菌表达系统表达重组ASFV P30蛋白,制备并鉴定P30蛋白单克隆抗体,建立检测ASFV的胶体金免疫层析法(GICA)。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET28a-P30,实现了重组P30蛋白的可溶性表... 为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫学诊断试剂,利用大肠杆菌表达系统表达重组ASFV P30蛋白,制备并鉴定P30蛋白单克隆抗体,建立检测ASFV的胶体金免疫层析法(GICA)。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET28a-P30,实现了重组P30蛋白的可溶性表达,且该重组蛋白与ASFV阳性血清可发生特异性反应;制备了10株稳定分泌P30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,腹水ELISA效价均高于1∶40000,与ASFV具有良好的反应性,且不与其他常见猪源病毒反应;利用2株单克隆抗体建立胶体金免疫层析法,可用于ASFV的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 大肠杆菌表达系统 单克隆抗体 胶体金免疫层析法

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基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立 被引量：9

3

作者 孙燕燕 赵亚茹 +9 位作者 李昕 杨吉飞 牛庆丽 林密 王兆贵 刘猛 关贵全 殷宏 蒋韬 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期939-945,共7页

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控... 为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 抗体检测 金纳米颗粒 免疫层析法

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非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用 被引量：7

4

作者 张锦 陈艳 +4 位作者 邹剑文 周江飞 龙云凤 姜焱 周斌 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第3期83-90,共8页

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)快速、高效和高通量的血清学诊断方法,本研究针对ASFV Pig/HLJ/2018毒株序列CP204L(p30)基因,构建了重组质粒pET-28a-p30,并通过原核表达系统获得ASFV重组p30蛋白,试验发现重组蛋白主要在包涵体中表达。经Weste... 为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)快速、高效和高通量的血清学诊断方法,本研究针对ASFV Pig/HLJ/2018毒株序列CP204L(p30)基因,构建了重组质粒pET-28a-p30,并通过原核表达系统获得ASFV重组p30蛋白,试验发现重组蛋白主要在包涵体中表达。经Western blot鉴定重组p30蛋白的反应原性良好。通过带有His标签的镍柱进行亲和层析,将纯化后的目的蛋白作为包被抗原,建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法。此方法引入S/P值进行阴阳性判定,其临界值为0.8。特异性试验表明本方法能够特异性地检测ASFV抗体。本方法批内变异系数在1.10%~6.70%之间,批间变异系数在1.08%~9.55%之间,均小于10%。灵敏性试验表明检测限可以达到1:1024。将本研究建立的方法和商品化试剂盒进行了符合率的比较,结果显示,阳性符合率为98.91%(91/92),阴性符合率为98.75%(158/160),总体符合率为98.8%(249/252)。研究表明,本方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性和符合率,表明其性能良好,具有较强的临床应用价值。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 间接ELISA 抗体检测

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非洲猪瘟病毒抗体ELISA检测方法的建立及初步评价 被引量：2

5

作者 郝丽影 孙杰 +7 位作者 王同燕 王彦伟 王磊磊 周倩 谭菲菲 逄文强 邓均华 田克恭 《动物医学进展》 北大核心 2023年第4期30-35,共6页

为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,分别用ASFV重组蛋白p30、p72、pA104R作为包被原建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并进行初步评价。结果显示,ASFV重组蛋白p30、p72及pA104R分别按照25 ng/孔、50 ng/孔、50 ng/孔包被,血清... 为建立非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,分别用ASFV重组蛋白p30、p72、pA104R作为包被原建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,并进行初步评价。结果显示,ASFV重组蛋白p30、p72及pA104R分别按照25 ng/孔、50 ng/孔、50 ng/孔包被,血清样品均100倍稀释,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG均20000倍稀释作为酶标试剂条件最优。p30-ELISA、p72-ELISA、pA104R-ELISA临界值分别为0.502、0.567、0.550。样品检测S/P值≥临界值判为阳性,否则判为阴性。3种方法分别检测梯度稀释的ASFV阳性血清、ASFV(CD2v缺失)阳性血清,p72-ELISA灵敏度最高,为1∶64、1∶128;3种方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清各5份,ASFV阴性血清200份,结果均为阴性;3种方法批间、批内重复性变异系数均小于10%。说明建立的方法均可用于ASFV的血清学检测,为非洲猪瘟的防控提供了多样化的检测方法。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 抗体检测 p30蛋白 p72蛋白 pA104R蛋白 间接酶联免疫吸附试验

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非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：7

6

作者 徐黎晖 迟立超 +5 位作者 王雨佳 李宝春 梁臻妮 周景云 杨欣艳 陈西钊 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期382-387,共6页

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp~549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白... 为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp~549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后的rP30作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立了一种快速检测ASFV P30抗体的血清学方法。结果显示,胞外分泌的rP30约为30 ku,western blot鉴定结果显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为0.4μg/mL,待检血清稀释倍数为1.25,血清反应时间为30 min,兔抗猪IgG-HRP稀释度为1.10000。利用该方法同时检测猪临床常见病毒阳性血清,结果显示建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV感染血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒和猪口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;将ASFV感染血清2倍倍比稀释后,利用本实验建立的ASFV抗体间接ELISA方法、ID.VET(P32)试剂盒和INGENASA(P72)试剂盒同时检测,结果显示本实验建立的方法检测灵敏度为1.128,与INGENANA(P72)试剂盒相同,低于ID.VET(P32)试剂盒(1.1024);批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性良好。利用该方法与ID.VET试剂盒同时对383份临床样品进行检测,二者符合率为98.9%。本研究建立的方法可为ASF的监测和防控提供技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 间接ELISA Cp204L基因 p30蛋白 杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立 被引量：6

7

作者 于浩洋 王彩霞 +5 位作者 吴绍强 宋晓晖 刘晓飞 仇松寅 冯春燕 林祥梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期48-55,共8页

为建立一种能检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究以真核表达后纯化的ASFV p30重组蛋白作为包被抗原,以特异性单抗作为阻断抗体,经条件优化、特异性试验和敏感性试验,建立了一种检测血清... 为建立一种能检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究以真核表达后纯化的ASFV p30重组蛋白作为包被抗原,以特异性单抗作为阻断抗体,经条件优化、特异性试验和敏感性试验,建立了一种检测血清中ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,纯化后的p30重组蛋白大小约为25 ku,建立的ASFV抗体阻断ELISA检测方法通过方阵试验优化后,最终确定了抗原最佳包被浓度为1μg/m L,待检血清最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为5%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶20 000,阴阳性血清临界值为35.11%。本方法与PCV3灭活阳性血清、PRRSV灭活阳性血清、SVA灭活阳性血清、PRV灭活阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。本方法检测ASFV阳性血清的敏感性可达1∶128。本试验建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,在非洲猪瘟的临床检测中具有广泛的应用价值。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 真核表达 单克隆抗体 阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1

8

作者 刘悦 魏天 +11 位作者 张春雨 张建峰 王成宇 张芳毓 朱日宁 鞠安琪 王思月 曲磊 张守峰 扈荣良 梁静 王永志 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期12-19,28,共9页

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化... 为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231~536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组蛋白能够在本氏烟草叶片中表达,且具有良好的反应原性;纯化的p30重组蛋白效果较好,能够被p30蛋白单克隆抗体识别。建立的ELISA检测方法最佳反应条件为抗原质量浓度0.5 mg/L,37℃包被1 h;待检血清1∶400倍稀释,37℃孵育0.5 h;HRP标记二抗37℃孵育0.5 h;TMB室温避光显色10 min;阴阳性临界值为0.461。当ASFV阳性血清稀释度为1∶2560时,仍检测为阳性,具有较高的敏感性;该方法与其他常见病阳性血清不发生交叉反应,能够特异性地检测ASFV抗体;重复性试验显示批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%;该方法与ASFV商品化检测试剂盒相比,总体符合率为85.0%。结果表明,本研究构建的PVY-p30重组病毒载体能介导p30重组蛋白在本氏烟草中表达,以植物表达的p30重组蛋白为抗原建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法可用于疾病的临床检测及疫情监测,同时为可饲疫苗的研发提供了基础材料 展开更多

关键词 间接ELISA 非洲猪瘟病毒 马铃薯Y病毒 植物生物反应器 p30蛋白

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非洲猪瘟病毒无标签p30-ELISA抗体检测方法的建立及应用 被引量：5

9

作者 于学祥 陈晓雨 +5 位作者 李栋凡 孙琪 库旭钢 范盛先 杨汉春 何启盖 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1517-1526,共10页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、出血性、高度接触性传染病,临床症状以败血症、皮炎和关节炎为特征,高发病率和高死亡率。为建立临床检测ASFV抗体的间接EL... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、出血性、高度接触性传染病,临床症状以败血症、皮炎和关节炎为特征,高发病率和高死亡率。为建立临床检测ASFV抗体的间接ELISA检测方法,本研究扩增了ASFV-CP204L基因,通过pET-30a原核表达系统表达p30蛋白,使用Ni-NTA纯化表达产物,通过肠激酶切除外源性蛋白,得到无His-组氨酸标签的p30蛋白,以此为诊断抗原,建立间接ELISA方法。结果显示:表达的无标签p30重组蛋白大小约为30 ku,与ASF阳性猪血清具有较好的反应原性;确定ELISA抗原包被浓度为1μg·mL^(-1),根据ROC曲线下面积确定S/P值>0.398判定为阳性,批内、批间变异系数均<10%;与PCV2、CSFV、PRV-gE、PRRSV阳性血清无交叉反应与INGENASA商品化试剂盒总符合率为97.78%。用该方法分别检测标准阳性血清、动物感染试验血清和收集的区域性临床血清644份,该方法最低可检测到1∶512倍稀释的标准阳性血清样品;检测感染动物血清,其中80%(4/5)的试验动物在第10天抗体为阳性。644份临床猪血清样品中抗体阳性率为7.61%,其中,母猪、后备母猪、仔猪、保育猪和育肥猪抗体阳性率分别为3.03%、0%、4.94%、7.55%和28.7%。本试验建立的ASFV-p30间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可应用于ASFV的抗体检测,为ASF的诊断和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 Cp204L基因 p30蛋白 原核表达 ELISA抗体检测

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立 被引量：5

10

作者 周改静 罗俊聪 +6 位作者 石正旺 万颖 杨波 曹丽艳 宋锐 田宏 郑海学 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4337-4345,共9页

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检... 为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均<10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒p30蛋白的真核表达纯化及单克隆抗体的制备 被引量：6

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作者 刘靖 钟杰 +4 位作者 陈伟业 王晗 张经伟 步志高 华荣虹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期1074-1079,共6页

为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp... 为构建表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的细胞系、纯化p30蛋白并制备单克隆抗体(MAb),本研究将ASFV p30基因序列经密码子优化并合成后克隆至pCAGneo载体中构建重组质粒pCAG-p30,经酶切鉴定正确后转染BHK-21细胞,经IFA鉴定重组p30蛋白(rp30)获得了表达。将表达rp30的细胞再经G418筛选并采用有限稀释法亚克隆后,采用IFA和western blot鉴定。IFA结果显示,经筛选获得的克隆细胞中有绿色荧光;western blot结果显示,克隆细胞在30 ku~38 ku出现3条特异性条带,表明获得了一株表达rp30的细胞ASFV-p30。表达的rp30利用镍柱亲和层析纯化并经western blot鉴定纯化效果后,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,经ELISA和亚克隆筛选MAb。获得的MAb经亚型试剂盒鉴定,并分别经IFA和western blot鉴定该MAb的反应性,采用间接ELISA方法检测MAb的腹水及细胞培养上清液效价,采用western blot检测该MAb与猪源病原ASFV、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的交叉反应性。结果显示,经ELISA和亚克隆筛选获得一株p30蛋白的MAb 13G2。亚型鉴定结果显示,该MAb重链为IgG1,轻链为κ型。IFA和western blot结果显示,该MAb与ASFV-p30细胞表达的p30蛋白有良好的反应原性。ELISA结果显示该MAb的腹水及培养上清效价分别为1.409600、1.1024。交叉反应性结果显示,仅ASFV感染的细胞与该MAb作用后出现特异性条带,而其他病原感染的细胞均无特异性条带,表明MAb 13G2的特异性较强。本研究首次利用哺乳动物细胞表达系统表达了ASFV p30蛋白,制备的蛋白更接近天然p30蛋白分子,以该蛋白制备的MAb用于检测ASFV更加准确,为ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速检测奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 真核表达 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位 被引量：5

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作者 魏天 王成宇 +6 位作者 王凤杰 李忠鹏 张芳毓 张守峰 扈荣良 吕礼良 王永志 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第15期3062-3070,共9页

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAbs)并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表... 【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,MAbs)并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4:1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验(IFA)。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗,通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs(8F4、1D3、1H2、6C3和8E11)与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均� 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 酶联免疫吸附试验 单克隆抗体 抗原表位

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非洲猪瘟病毒p35蛋白作为诊断抗原的抗原性比较 被引量：5

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作者 施磊 田占成 +8 位作者 杨吉飞 高闪电 独军政 赵亚茹 刘志杰 关贵全 刘光远 罗建勋 殷宏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期187-195,共9页

为了筛选出酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)反应性最佳的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)诊断抗原,通过建立ELISA方法,以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达的ASFV p30蛋白诊断抗原为参照,首次探... 为了筛选出酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)反应性最佳的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)诊断抗原,通过建立ELISA方法,以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达的ASFV p30蛋白诊断抗原为参照,首次探讨原核表达系统表达的ASFVp35蛋白作为诊断抗原的抗原性和潜力。免疫印迹和免疫荧光结果表明,获得了40 kDa的重组p35蛋白和30 kDa的p30蛋白,两种蛋白与ASFV阳性血清均具有较好的免疫反应原性。采用重组p30和p35蛋白作为诊断抗原分别建立ELISA方法,并验证其敏感性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,尽管p35-ELISA方法的检测敏感性稍低于p30-ELISA方法,但其敏感性仍可达95.8%,且p35-ELISA方法和p30-ELISA方法的批内和批间变异系数均小于10%。p35-ELISA方法与进口试剂盒比较,符合率达97.2%。结果表明建立的p35-ELISA方法敏感性高且稳定性好,可应用于ASFV感染血清的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p35蛋白 p30蛋白 抗原性 间接ELISA

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非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立 被引量：4

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作者 张冯禧 肖琦 +7 位作者 朱家平 尹力鸿 赵霞玲 严明帅 徐晋花 温立斌 牛家强 何孔旺 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第16期3256-3266,共11页

【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,... 【背景】非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单� 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体 抗原表位 阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

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作者 马天天 张亚楠 +8 位作者 冯亚文 岳怀宁 王亚文 苏恺 袁晨 逯纪成 孙泰然 薛文阁 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2832-2842,共11页

【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小... 【目的】制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p30蛋白单克隆抗体,为ASFV检测方法的研究提供重要试验材料。【方法】应用大肠杆菌表达重组ASFV p30蛋白,并用该蛋白免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠,应用细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合;通过间接ELISA方法筛选分泌p30蛋白特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,腹腔接种小鼠制备腹水抗体;应用ELISA方法鉴定单克隆抗体的类/亚类,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体与p30-N端(1―105位氨基酸)和p30-C端(100―194位氨基酸)区域的反应活性;针对抗体识别的p30蛋白区域合成不同肽段,通过ELISA和斑点免疫印迹法鉴定抗体识别的抗原表位。应用间接ELISA方法分析单克隆抗体与ASFV p72蛋白、猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳(Cap)蛋白、猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的交叉反应性,以及ASFV抗血清对单克隆抗体抗原结合活性的阻断作用。【结果】获得了2株杂交瘤细胞(C7和G10),其分泌的单克隆抗体(C7和G10)都属于IgG1亚类和κ型(IgG1κ),杂交瘤细胞培养上清和腹水内C7和G10的抗体效价分别为1∶1280、1∶640与1∶10^(7)、1∶10^(6);2株抗体均与p30-C端(100―194位氨基酸)区域特异性结合,并识别同一个抗原表位115 CTSSFETLFEQEPSSEVPKD^(134);2株抗体与ASFV p72蛋白、PCV2 Cap蛋白及PEDV S蛋白无交叉反应;ASFV抗血清能有效阻断2株单克隆抗体与p30蛋白结合。【结论】获得2株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,鉴定了单克隆抗体的抗原识别表位,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为ASFV致病机制的进一步研究提供支撑。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 单克隆抗体 表位

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非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：1

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作者 刘桃雪 苏冰倩 +5 位作者 齐艳丽 郭江涛 刘忠虎 褚贝贝 王江 曾磊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期3415-3423,共9页

为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选。结果获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗... 为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的单克隆抗体,以原核表达的重组p30蛋白为免疫原免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选。结果获得2株能稳定分泌抗ASFV p30蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G10-2和6D2-1。抗体效价分别为1∶12800和1∶3200。亚型鉴定结果显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG,轻链均为κ型。Western blot和间接免疫荧光试验结果显示,2株单克隆抗体与p30蛋白均具有良好的结合活性。通过Western blot检测,2株单克隆抗体能有效结合截短重组p30蛋白的170~194位氨基酸,证明其抗原识别区域为第170~194位氨基酸。本研究制备了p30蛋白的2株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为ASFV p30蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 原核表达 单克隆抗体 抗原表位

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非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：5

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作者 荣明轩 徐保娟 +9 位作者 南文龙 范根成 李国攀 王席 陈清清 胡基雄 李欢 谢明 张志翔 荣俊 《中国动物检疫》 CAS 2021年第5期109-118,共10页

为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了... 为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了特异性、灵敏性、重复性试验;同时与基于ASFV P30-2His6蛋白(N、C末端各融合1个His6标签)的iELISA方法进行兽医临床样本比较试验。结果显示:重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在Western-blot检测中,均能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交带;基于重组ASFV P30蛋白iELISA的最佳反应条件为,抗原蛋白包被质量浓度20μg/mL、血清样品稀释度1:1000、酶标二抗稀释度1:40000、血清样品检测OD450阳性结果临界值0.22。该方法仅对ASFV阳性血清呈特异性反应,1:3200稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验变异系数均小于10%,可以消除His标签所造成的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30 iELISA检测方法为ASFV抗体检测提供了一种有效手段。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 原核表达 p30蛋白 间接ELISA 组氨酸标签 抗体检测

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基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法 被引量：1

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作者 董春娜 张蕾 +3 位作者 李静 李鹏宇 齐鹏 肖进 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第3期36-40,共5页

为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法,本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体,进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体,采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行... 为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法,本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体,进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体,采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行该单克隆抗体的表达。以p30重组蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为阻断抗体建立了一种非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测方法,并验证其敏感性、特异性以及与商品化试剂盒的符合率。结果显示,该方法敏感性为100%,特异性为100%,与商品化试剂盒比较,符合率为98.7%。结果表明,本试验基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法敏感性好、特异性强,结果准确可靠,可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 阻断ELISA

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非洲猪瘟病毒P30蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立 被引量：1

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作者 张芳源 蔺雅婷 +3 位作者 杨大为 陈虎 李桂梅 单虎 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期2012-2022,共11页

【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP 204 L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克... 【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP 204 L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克表达载体,构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用纯化后的P30重组蛋白作为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化,检验该方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达,在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16℃诱导12 h时蛋白表达量最高,不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示,P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法抗原最佳包被浓度为1μg/mL,使用1%BSA溶液封闭效果最佳,血清最佳稀释度为1∶600,酶标二抗最佳工作浓度为1∶8000,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与商品化试剂盒总符合率达到96.7%。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV的P30蛋白,建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法,为非洲猪瘟的监测、诊断及试剂盒开发提供了参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白 原核表达 间接ELISA

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1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定 被引量：3

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作者 陈孝军 马俊 +9 位作者 陈熊男 梁祎凡 高琦 黄钊 许润达 郑佳琛 郑泽中 张桂红 王衡 龚浪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2239-2251,共13页

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备... 旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为^(84)M~K^(142);噬菌体淘选试验结果表明,^(116)TSSFETLFE^(124)为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 单克隆抗体 生物淘选 抗原表位

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