蛋白质的氧化重折叠 被引量：8

1

作者 张渝英 杨开宇 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期1-8,共8页

经过近几十年来广泛而深入的研究 ,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。 1 在已研究过的蛋白质中 ,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠 ,这与折叠能量景观学说是一致的。 2 正是氨基酸残基间的... 经过近几十年来广泛而深入的研究 ,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。 1 在已研究过的蛋白质中 ,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠 ,这与折叠能量景观学说是一致的。 2 正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)折叠中所起的重要作用并非相互排斥 ,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需 ,与控制肽链折叠无直接关系。 3 根据对BPTI的研究 ,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用 ,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明 ,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成 ,更具有普遍意义。 4 在氧化重折叠的早期 ,二硫键的形成基本上是一个随机过程 ,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外 ,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述 ,在折叠的后期 。 展开更多

关键词 氧化重折叠 复性率 二硫键 重组蛋白质

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rhIFN-κ包涵体的氧化复性与纯化

2

作者 吴佳奇 张宇翔 +5 位作者 张路瑶 颜灵樱 余蓉 刘永东 张耀 张纯 《过程工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期1667-1675,共9页

干扰素卡帕(Interferon-Kappa, IFN-κ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等重要功能的蛋白质,独特的分泌方式和生理功能使其在临床上具有良好的应用前景。通过大肠杆菌以包涵体形式表达的重组人干扰素卡帕(rhIFN-κ)需要经过体外折... 干扰素卡帕(Interferon-Kappa, IFN-κ)是一种具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等重要功能的蛋白质,独特的分泌方式和生理功能使其在临床上具有良好的应用前景。通过大肠杆菌以包涵体形式表达的重组人干扰素卡帕(rhIFN-κ)需要经过体外折叠复性才能获得生物活性,由于IFN-κ含两对二硫键,因此复性时面临易生成沉淀和二硫键难以正确氧化等双重挑战。本研究采用强阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶解包涵体,并在复性过程添加多元醇2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)逐渐剥离与蛋白质紧密结合的SDS,实现rhIFN-κ的氧化复性。研究发现,rhIFN-κ复性后主要形成了二硫键不同氧化程度的三种结构,包括完全氧化的正确结构、部分氧化的中间体和完全未氧化的变性蛋白。在SDS/MPD复性体系中,rhIFN-κ完全氧化的复性收率与两者浓度及比例密切相关。SDS浓度过低或MPD浓度过高易导致蛋白质沉淀或聚集,SDS浓度过高或MPD浓度过低则会抑制二硫键的正确氧化。进一步对氧化还原体系及pH值进行优化,确定了最优的复性缓冲液:添加0.05wt%SDS, 1 mol/L MPD, 0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG), 0.1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)的20 mmol/L Tris, pH=9.5。且在此条件下,蛋白质浓度提高至2.0 mg/mL时,rhIFN-κ复性收率基本不变。室温复性24 h,rhIFN-κ的复性收率达66%。利用制备反相高效液相色谱一步纯化,可有效去除杂质及复性中间体等错误结构,获得非还原电泳为单一条带的纯度90%的rhIFN-κ。结果表明,SDS/MPD体系能抑制包涵体复性时沉淀形成的同时还能有效提高二硫键的正确氧化,该结果可为rhIFN-κ的规模化生产奠定良好的基础。 展开更多

关键词 重组人IFN-κ 包涵体 氧化复性 SDS/MPD复性系统

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敬钊毒素-Ⅴ的合成、复性及其钾通道活性鉴定 被引量：1

3

作者 曾雄智 邓梅春 +2 位作者 孙正华 王贤纯 梁宋平 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期463-468,共6页

敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高... 敬钊毒素-Ⅴ(jingzhaotoxin-Ⅴ,JZTX-Ⅴ)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化得到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂.为了深入研究该毒素的功能,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相方法化学合成了JZTX-Ⅴ,合成多肽经谷胱甘肽法氧化复性后,利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化.复性产物的相对分子质量经质谱测定为3605.51,而与天然毒素混合进行HPLC共洗脱实验时也只得到单一峰.全细胞膜片钳实验显示,JZTX-Ⅴ能够抑制大鼠背根神经节细胞上的A型钾电流,却对外向延迟整流钾电流没有影响,对处于静息关闭状态的A-型钾通道也表现出较高的亲和性.JZTX-Ⅴ对A型钾通道的这种抑制作用具有浓度依从性,其半数有效抑制浓度(IC50)为52.3nmol/L·JZTX-Ⅴ通过引起A型钾通道的活化曲线往去极化方向漂移,和失活曲线往超极化方向漂移来改变通道的门控特征.目前的研究结果为深入开展JZTX-Ⅴ的功能研究及分子改造奠定了基础. 展开更多

关键词 敬钊毒素-Ⅴ(JZTX-Ⅴ) 固相多肽合成 氧化复性 全细胞记录 钾电流

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Lys4突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响 被引量：1

4

作者 曾雄智 邓梅春 +3 位作者 彭莹 魏文廷 王贤纯 梁宋平 《生命科学研究》 CAS CSCD 2008年第1期20-23,共4页

敬钊缨毛蛛毒素-V(jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第4位赖... 敬钊缨毛蛛毒素-V(jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第4位赖氨酸残基的突变体K4A-JZTX-V,合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物分别用MALDI-TOF/TOF质谱进行相对分子质量的鉴定,用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析.研究结果表明,Lys4被Ala取代后,K4A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V基本相当,提示Lys4与JZTX-V对TTX-S钠通道的抑制活性关系不大;而K4A-JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约8.3倍,说明Lys4是JZTX-V与河豚毒素不敏感型钠通道抑制活性相关的氨基酸残基. 展开更多

关键词 敬钊缨毛蛛毒素-V 固相多肽合成 突变体 氧化复性 膜片钳

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Arg20突变对敬钊缨毛蛛毒素-V钠通道活性的影响 被引量：1

5

作者 曾雄智 邓梅春 +3 位作者 皮建辉 全妙华 王贤纯 梁宋平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1228-1232,共5页

敬钊缨毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第20位... 敬钊缨毛蛛毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第20位精氨酸残基的突变体R20A-JZTX-V,合成线性多肽经反相高效液相色谱分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性。复性产物分别用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)进行分子量的鉴定,用膜片钳电生理方法进行电压门控钠通道抑制活性分析。研究结果表明,Arg20被Ala取代后,R20A-JZTX-V对大鼠背根神经节细胞(DRG)膜上表达的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的抑制活性与天然JZTX-V相当,提示Arg20与JZTX-V对TTX-S钠通道的抑制活性无关或关系不大;而R20A-JZTX-V对TTX-R钠通道的抑制活性却比天然JZTX-V下降了约18.3倍,说明Arg20是与JZTX-V对河豚毒素不敏感型(TTX-R)钠通道抑制活性相关的关键活性残基之一,推测R20A-JZTX-V活性降低的原因是用Ala替代Arg20后改变了JZTX-V与TTX-R型钠通道的作用位点。 展开更多

关键词 敬钊缨毛蛛毒素-V固相多肽合成 突变体 氧化复性 膜片钳

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敬钊毒素-V突变体K12A-JZTX-V的化学合成与氧化还原复性

6

作者 曾雄智 全妙华 +1 位作者 皮建辉 梁宋平 《怀化学院学报》 2008年第5期41-43,共3页

敬钊毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,由29个氨基酸残基组成,含有三对二硫键.为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了... 敬钊毒素-V(Jingzhaotoxin-V,JZTX-V)是从敬钊缨毛蛛粗毒中纯化到的一种新型河豚毒素不敏感型钠通道抑制剂,由29个氨基酸残基组成,含有三对二硫键.为了深入研究该毒素的结构与功能关系,应用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成方法合成了用丙氨酸(Ala)替代JZTX-V第12位赖氨酸残基的突变体K12A-JZTX-V,合成粗品经反相高效液相色谱分离纯化和MALDI-TOF质谱鉴定,证明化学合成是成功的.线性多肽经谷胱甘肽氧化复性后,复性产物经质谱测定其相对分子量为3549.63,比线性分子的理论分子质量低6,说明六个半胱氨酸已经配对形成了三对二硫键. 展开更多

关键词 敬钊缨毛蛛毒素-V 固相多肽合成 突变体 氧化复性 质谱

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海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ的固相化学合成和氧化复性

7

作者 皮建辉 全妙华 曾雄智 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期399-403,共5页

应用芴甲氧羰基(Fm o c)固相化学合成了海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ,并优化了其最佳氧化复性条件。最佳的氧化复性条件为pH7.5的重蒸水溶液体系,样品质量浓度为0.1g/L,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的浓度分别为1.0mm o l/L和0.1mm o l/L、L-A... 应用芴甲氧羰基(Fm o c)固相化学合成了海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ,并优化了其最佳氧化复性条件。最佳的氧化复性条件为pH7.5的重蒸水溶液体系,样品质量浓度为0.1g/L,还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的浓度分别为1.0mm o l/L和0.1mm o l/L、L-A rg浓度为1.0m o l/L。复性产物经质谱测定其相对分子质量为3 607.68;与天然毒素等量混合后用高效液相色谱分析得到单一峰;膈神经-膈肌标本生理实验结果表明,合成的毒素具有与天然毒素相同的生物学活性,从而可确定二者在结构与功能上具有一致性。 展开更多

关键词 固相化学合成 海南捕鸟蛛毒素-Ⅲ 氧化复性 结构与功能 反相高效液相色谱 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

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Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

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作者 邓梅春 罗旋 +2 位作者 陈汉春 王军 梁宋平 《生命科学研究》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期111-115,共5页

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽... 虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础. 展开更多

关键词 虎纹毒素-IV(HWTX—IV) 突变体 固相多肽合成 氧化复性 钠通道

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敬钊毒素-XI与突变体R3A-JZTX-XI的合成、复性及其药理活性鉴定

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作者 池宇朋 邓梅春 +6 位作者 吴远远 罗吉 容明强 张亦雅 张东裔 曾雄智 梁宋平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期900-908,共9页

表达于β-胰岛细胞上的Kv2.1钾通道电流负责动作电位的复极化,从而调节胰岛素的分泌,是治疗2型糖尿病的有效作用靶点。敬钊毒素-XI(JZTX-XI)是从敬钊缨毛蛛Chilobrachys jingzhao粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素,能够抑制非... 表达于β-胰岛细胞上的Kv2.1钾通道电流负责动作电位的复极化,从而调节胰岛素的分泌,是治疗2型糖尿病的有效作用靶点。敬钊毒素-XI(JZTX-XI)是从敬钊缨毛蛛Chilobrachys jingzhao粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素,能够抑制非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv2.1钾通道电流。为了研究JZTX-XI的结构与功能关系,用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合成方法合成了野生型JZTX-XI和突变体R3A-JZTX-XI,结合反相HPLC和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行检测,从而得到合成多肽的最佳氧化复性条件。复性产物经质谱测定其相对分子质量与理论分子质量相符。复性JZTX-XI与天然毒素等量混合后用高效液相色谱分析也只得到单一峰。膜片钳电生理活性分析结果显示,JZTX-XI对瞬时表达于HEK293T细胞的钾通道亚型hKv2.1和钠通道亚型hNav1.5电流具有非常强的抑制作用,其半数有效抑制浓度(IC50)分别为95.8 nmol/L和437.1 nmol/L。当第3位Arg被Ala取代后,突变体R3A-JZTX-XI对同样表达的hKv2.1和hNav1.5通道电流的IC50值分别为1.22μmol/L和1.96μmol/L。以上实验结果表明突变体R3A-JZTX-XI对hKv2.1和hNav1.5通道的抑制活性分别比天然JZTX-XI降低了12.7倍和4.5倍,说明第3位的Arg残基既是负责JZTX-XI与hKv2.1通道相互作用的关键活性残基,也是与hNav1.5通道活性相关的氨基酸残基。目前的研究结果对研发胰脏钾通道Kv2.1的分子探针和以Kv2.1通道为靶点的药物设计具有借鉴作用。 展开更多

关键词 敬钊毒素-XI(JZTX-XI) 固相多肽合成 氧化复性 钾通道Kv2.1 钠通道Nav1.5

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大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶β亚基体外分子交联

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作者 徐燕 高音 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1485-1489,共5页

为证明高音等提出的蛋白质交联三步假说,通过PCR技术扩增大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶β亚基(L-tartrate dehydratase beta subunit,TtdB)野生型与Cys/Ser突变型目的基因,构建带6×His标签的诱导型表达载体pTrcHisC-TtdB。重组蛋白以包... 为证明高音等提出的蛋白质交联三步假说,通过PCR技术扩增大肠杆菌L-酒石酸脱氢酶β亚基(L-tartrate dehydratase beta subunit,TtdB)野生型与Cys/Ser突变型目的基因,构建带6×His标签的诱导型表达载体pTrcHisC-TtdB。重组蛋白以包含体形式存在,应用TALON固定化金属亲和树脂(Immobilized metal affinity chromatography,IMAC)以变性的方法纯化,通过分步透析逐步去除变性剂的方法复性,复性率可达70%。将复性后的两种蛋白通过热诱导去折叠和氧化重折叠方法进行体外蛋白质分子交联实验。SDS-PAGE分析表明:野生型TtdB在其变性的临界温度反应时,出现交联二聚体和多聚体;在氧化重折叠后SDS-PAGE前加入100mmol/LDTT时,交联强度明显减弱。这种DTT打不开的交联即为异肽键交联;若在其氧化重折叠反应液中加入DTT则没有任何交联。突变型TtdB在与野生型TtdB相同的热诱导去折叠条件下,完全没有二聚体和多聚体的形成。这说明分子间二硫键的形成能促进随后分子间异肽键的形成。 展开更多

关键词 酒石酸脱氢酶β亚基 蛋白质交联 热诱导去折叠和氧化重折叠 二硫键 异肽键

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重组Hepcidin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定

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作者 王继雯 谢宝恩 +2 位作者 甄静 周伏忠 陈国参 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期192-195,共4页

将诱导表达的His-hepcidin融合蛋白包涵体通过固定化金属离子配体亲和层析(IMAC)柱分离纯化后,在cys-teine/cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键,稀释复性后用肠激酶将融合蛋白的his-tag切除。酶切后所得的Hepcidin经抑菌圈试验检验,... 将诱导表达的His-hepcidin融合蛋白包涵体通过固定化金属离子配体亲和层析(IMAC)柱分离纯化后,在cys-teine/cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键,稀释复性后用肠激酶将融合蛋白的his-tag切除。酶切后所得的Hepcidin经抑菌圈试验检验,对枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有抗菌活性。 展开更多

关键词 HEPCIDIN 纯化 氧化复性 抑菌圈

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