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线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响
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作者 谢珊珊 杨琴 +3 位作者 邓肖玉 易继海 王震 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第1期283-293,共11页
【目的】试验旨在探究线粒体融合蛋白2(MFN2)基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。【方法】利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列(siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275)和1条阴性干扰序列(siMFN2-... 【目的】试验旨在探究线粒体融合蛋白2(MFN2)基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。【方法】利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列(siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275)和1条阴性干扰序列(siMFN2-Negative);利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数∶细胞个数=100∶1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相关X蛋白(BAX)的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。【结果】双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低(P<0.01),pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加(P<0.01),成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组(P<0.05),BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组(P<0.01);布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.05),细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组(P<0.01)。【结论】本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。 展开更多
关键词 线粒体融合蛋白2(mfn2) 布鲁氏菌 巨噬细胞 凋亡
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