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小环载体介导的siRNA稳定抑制乙肝病毒的复制和表达 被引量：3
1
作者 刘晓曼 杨倬 冯涛 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期191-197,共7页
【目的】尝试构建表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的小环载体,并初步鉴定其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及其基因表达的抑制作用。【方法】设计并合成靶向HBV S区的siRNA,将其克隆到小环载体pMC.BESPX-MCS2上,测... 【目的】尝试构建表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的小环载体,并初步鉴定其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及其基因表达的抑制作用。【方法】设计并合成靶向HBV S区的siRNA,将其克隆到小环载体pMC.BESPX-MCS2上,测序正确后将重组体pMC-H1-siHBS-U6转化入感受态E.coliZYCY10P3S2T,然后在培养基中加入L-阿拉伯糖,诱导其降解细菌骨架,获取只含有目的基因表达盒的小环RNA干扰载体pmc-H1-siHBS-U6。将小环RNA干扰载体与HBV真核表达质粒pHBV1.3共转染Huh-7细胞,分别在转染后1-7天,ELISA法检测Huh-7细胞上清中的HBsAg、HBeAg,并且通过Real-time RT-PCR法分析干扰RNA对HBV DNA及mRNA的抑制效果。【结果】成功构建了靶向HBV S基因的siRNA小环表达载体pmc-H1-siHBS-U6。该载体能显著抑制Huh-7细胞HBsAg和HBeAg分泌,并且其抑制效果能够维持2-3周时间。Real-time PCR证实HBV的DNA与mRNA水平分别降低了71%和80%,而对照siRNA及空载体则无此作用。【结论】成功构建了靶向HBV的小环RNA干扰载体,并且其能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达与复制,该研究不仅对探索HBV的基因治疗提供了重要线索,而且为RNA干扰的应用提供了新的运载体系。 展开更多
关键词 小环载体 乙肝病毒(hepatitis B VIRUS HBV) RNA干扰 HUH-7细胞
原文传递
载体介导无遗传物质整合的诱导性多能干细胞的生成 被引量：1
2
作者 栗楠 郭红梅 +6 位作者 王明玉 令文慧 邱小燕 李跃民 刘旭蕾 邓雅楠 肖雄 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2017年第11期1486-1496,共11页
诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)因其具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的"自我更新"和分化潜能而成为生物学和医学等领域的研究热点之一。但是,目前i PSCs的生成主要以逆转录病毒或... 诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)因其具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)的"自我更新"和分化潜能而成为生物学和医学等领域的研究热点之一。但是,目前i PSCs的生成主要以逆转录病毒或慢病毒为载体,而病毒载体和外源性重编程因子在受体细胞基因组中的整合,使得i PSCs存在致瘤性的安全隐患。同时,采用无载体介导的方法如重组蛋白、小分子物质的重编程效率较低。为此,目前已成功开发一些载体和方法可以介导无外源性遗传物质整合的i PSCs的生成。该文就整合后可删除的基因表达载体(Cre/lox P重组系统、piggy Bac转座子/转座酶系统)和非整合基因表达载体(ori P/EBNA1附加型载体、微环DNA载体)在i PSCs生成上的应用研究作一综述,以期为i PSCs的临床安全应用提供理论和技术参考。 展开更多
关键词 诱导性多能干细胞(iPSCs) CRE/LOXP重组系统 piggyBac转座系统 oriP/EBNA1附加型载体 微环dna载体
原文传递
人内皮抑素小环载体在真核细胞中的生物活性
3
作者 徐本玲 袁龙 +2 位作者 赵鹏 吴江雪 黄文林 《山东医药》 CAS 北大核心 2010年第28期66-68,共3页
目的通过对人内皮抑素小环载体在真核细胞中的表达和生物学效应的研究,探讨小环载体作为生物治疗载体的可行性。方法将mc-hES、pcDNA-hES分别转染人肝癌细胞HepG2后,通过ELISA、RT-PCR和Westernblot观察hES表达。MTT法检测其对人脐静脉... 目的通过对人内皮抑素小环载体在真核细胞中的表达和生物学效应的研究,探讨小环载体作为生物治疗载体的可行性。方法将mc-hES、pcDNA-hES分别转染人肝癌细胞HepG2后,通过ELISA、RT-PCR和Westernblot观察hES表达。MTT法检测其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖抑制作用。结果 mc-hES和pcDNA-hES均能表达hES,mc-hES能明显抑制HUVEC的生长,而对HepG2无明显作用(P<0.05)。在相同条件下,小环较常规质粒在体外能快速介导转基因的表达,且较传统质粒高6～8.3倍。结论 mc-hES较普通质粒pcDNA-hES在肝癌细胞中能高效表达转基因,为小环载体进一步研究提供了很好的实验基础。 展开更多
关键词 小环dna载体 内皮抑素 非病毒载体 质粒
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应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA 被引量：6
4
作者 朱园飞 李改云 +3 位作者 常豪 鱼康康 高月求 邓强 《微生物与感染》 2017年第4期229-234,共6页
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^(lo... 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^(loxP))产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2TPhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^(attR)微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^(attR)尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。 展开更多
关键词 微环dna技术 PhiC31 位点特异性重组 乙型肝炎病毒 共价闭合环状dna
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