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不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究 被引量:2
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作者 张磊 薛峰 +2 位作者 严杰 毛亚飞 李立伟 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2008年第6期564-571,共8页
目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因... 目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况,采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清,免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A.1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果:我国13株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体三宝垄群patoc型Patoc株则否。与报道的序列(GenBank accession No.:NP_712236)比较,所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.02%~100%和97.91%~100%。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量为细菌总蛋白的5%。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,且其转录水平呈细胞接触上调模式,表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 基因表达 序列分析 DNA mce基因 克隆/表达 实时荧光定量RT—PCR
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问号钩端螺旋体mce基因及其编码蛋白特征的初步分析
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作者 吴锦芳 张磊 孙继民 《中国媒介生物学及控制杂志》 CAS CSCD 2012年第2期135-140,共6页
目的建立基于mce基因的PCR检测方法,分析问号钩端螺旋体(钩体)mce基因保守性,获得钩体mce基因生物信息学分析结果。方法以NCBI/Blast、NCBI/Cds软件搜索Mce内部存在的保守功能结构域及mce基因的特异性;采用TMHMM Server-2.0预测所编码... 目的建立基于mce基因的PCR检测方法,分析问号钩端螺旋体(钩体)mce基因保守性,获得钩体mce基因生物信息学分析结果。方法以NCBI/Blast、NCBI/Cds软件搜索Mce内部存在的保守功能结构域及mce基因的特异性;采用TMHMM Server-2.0预测所编码蛋白跨膜区结构;根据已报道问号钩体赖株mce基因设计引物,采用PCR扩增问号钩体赖株全长mce基因,测序并使用DNAStar软件进行测序结果比对。以13株国内流行问号钩体菌株基因组DNA为模板,对基于mce基因PCR检测方法进行验证。扩增产物进行测序、比对,同时根据推定的氨基酸序列做系统发生树。结果生物信息学研究表明,Mce含有与病原菌黏附侵袭相关的Mce超家族保守功能结构域;Mce中存在一明显的跨膜结构;同时,mce基因特异存在于问号钩体中;所克隆的mce基因与已报道序列(GenBank accession No.:NP_712236)一致;PCR检测结果表明,我国13株问号钩体株均携带mce基因;核苷酸和氨基酸序列相似性均>95%。结论问号钩体mce基因特异、保守存在于各致病性的问号钩体中;Mce具有明显的跨膜结构并含有Mce超家族结构域,与问号钩体黏附侵袭宿主细胞有关。 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 mce基因 蛋白特征
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鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株的构建及其相关功能研究 被引量:3
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作者 李和桥 李振军 +4 位作者 肖琪 宋韩 孙丽娜 吉兴照 楼永良 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期35-41,共7页
目的构建鼻疽诺卡菌IFM10152哺乳动物侵袭基因4A(mammalian cell entry 4A,mce4A)缺失株,并分析该基因在鼻疽诺卡菌感染宿主细胞中发挥的作用。方法采用无抗生素标记的框内缺失法构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,通过PCR及测序的方法进... 目的构建鼻疽诺卡菌IFM10152哺乳动物侵袭基因4A(mammalian cell entry 4A,mce4A)缺失株,并分析该基因在鼻疽诺卡菌感染宿主细胞中发挥的作用。方法采用无抗生素标记的框内缺失法构建鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,通过PCR及测序的方法进行验证。进行体外生长实验、用THP-1(人白血病单核细胞系)作为体外模型进行巨噬细胞杀菌试验以及用HeLa(宫颈癌上皮细胞系)细胞进行体外黏附侵袭试验来分析mce4A基因在鼻疽诺卡菌与宿主细胞相互作用中发挥的功能。结果成功构建无抗生素标记的mce4A基因框内缺失株,命名为△mce4A;缺失株与野生株生长速度无明显差异。通过实验证明,mce4A基因敲除后,鼻疽诺卡菌抵抗巨噬细胞杀伤能力明显减弱,且鼻疽诺卡菌的黏附侵袭能力也明显减低。结论成功构建了鼻疽诺卡菌mce4A基因缺失株,mce4A基因在鼻疽诺卡菌黏附侵袭宿主细胞及巨噬细胞内存活过程中可能发挥了重要作用。 展开更多
关键词 鼻疽诺卡菌 基因敲除 mce4A基因 细菌存活 黏附侵袭
原文传递
诺卡氏菌mce1A基因的克隆及重组表达 被引量:2
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作者 高芳 许海东 +4 位作者 徐力文 苏友禄 郭志勋 蒋魁 冯娟 《南方水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期94-103,共10页
诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是近年来海淡水养殖鱼类频发慢性传染病的病原菌。该研究通过引物扩增得到全长1 254 bp、编码417个氨基酸的诺卡氏菌毒力因子mce1A基因的全序列。该基因编码蛋白质的分子量约为43.98 k D,理论等电点5.14... 诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是近年来海淡水养殖鱼类频发慢性传染病的病原菌。该研究通过引物扩增得到全长1 254 bp、编码417个氨基酸的诺卡氏菌毒力因子mce1A基因的全序列。该基因编码蛋白质的分子量约为43.98 k D,理论等电点5.14,含有161个疏水性氨基酸,疏水性平均值为0.044,为疏水性蛋白,具有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲3种结构。经预测,Mce1A有MCE、DUF3407区域、OM_asym_Mla D、Mtu_fam_mce、Mla D 5个结构域,彼此交叠,含有公共区域。根据Mce1A氨基酸构建的系统进化树可以发现诺卡氏菌和新星诺卡氏菌的亲缘关系最近。构建p ET32a-mce1A重组质粒并转化至大肠埃希菌BL21中,得到的重组蛋白的相对分子量约63 k D。温度、IPTG浓度对重组蛋白表达量没有影响。该研究为进一步研究Mce1A的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 诺卡氏菌 mce1A基因 原核表达
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