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基于双酶级联协调表达策略高效催化合成D-甘露醇 被引量：6
1
作者 潘珊 胡孟凯 +4 位作者 潘学玮 吕青兰 朱荣帅 张显 饶志明 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期2549-2565,共17页
D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶Lp MDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖... D-甘露醇(D-mannitol)作为合成抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体被广泛应用于制药和医疗等行业,酶法合成D-甘露醇反应成本昂贵无法满足工业化生产。本研究首先筛选关键酶获得较优性能的甘露醇脱氢酶Lp MDH和用于辅因子NADH再生的葡萄糖脱氢酶Ba GDH,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中共表达,实现了基于双酶级联反应催化底物D-果糖合成D-甘露醇,D-甘露醇的初步摩尔转化率为59.7%。针对双酶级联催化反应中辅酶再生用酶与催化用酶表达量不协调的问题,通过增加Bagdh拷贝量来提高辅因子循环能力,获得了双酶催化速率平衡的重组大肠杆菌E.coli BL21/pETDuet-Lpmdh-Bagdh-Bagdh。进一步对重组菌的全细胞转化条件进行优化,确定了最适转化条件为反应温度30℃,初始pH值6.5,菌体量OD600=30,底物D-果糖100.0 g/L,辅底物葡萄糖与底物1︰1摩尔当量。于最优转化条件下5 L发酵罐转化24 h,D-甘露醇的最高产量为81.9g/L,摩尔转化率为81.9%。本研究提供了一种绿色、高效生物催化生产D-甘露醇的方法,为实现其规模化生产奠定了基础,同时也对其他相关稀有糖醇的研究具有指导意义。 展开更多
关键词 D-甘露醇 D-甘露醇脱氢酶 双酶协调表达系统 NADH循环 全细胞转化
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以蔗糖为底物利用重组大肠杆菌合成甘露醇 被引量：7
2
作者 陈艳 田康明 +2 位作者 李玉 王正祥 路福平 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期2182-2190,共9页
【目的】异型发酵乳酸菌可利用胞内产生的甘露醇脱氢酶将果糖高效转化为甘露醇,但果糖作为底物相对昂贵,不利于工业化生产。为了降低生产成本,必须选择廉价的底物。蔗糖相对便宜,并且大量存在于自然界中,能够被重组大肠杆菌利用产生甘... 【目的】异型发酵乳酸菌可利用胞内产生的甘露醇脱氢酶将果糖高效转化为甘露醇,但果糖作为底物相对昂贵,不利于工业化生产。为了降低生产成本,必须选择廉价的底物。蔗糖相对便宜,并且大量存在于自然界中,能够被重组大肠杆菌利用产生甘露醇。蔗糖水解酶(Sucrose hydrolase)和甘露醇脱氢酶(Mannitol dehydrogenase)是发酵生产甘露醇中催化蔗糖转化成甘露醇的关键酶,构建蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶共表达菌株并进行相关研究是本文的主旨。【方法】利用PCR方法分别从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)基因组DNA中获得sac A和mdh基因,得到大小分别为1 502 bp和1 032 bp的目的基因,经序列分析后将其连接到表达载体p ET-28a(+)上,得到重组表达载体p ET28a-sac A-mdh。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况并测定其酶活。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为55.1 k D和37.8 k D,与预期分子量一致,实现sac A和mdh基因的表达。蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活分别为25.78 U/m L和14.56 U/m L。对重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-sac A-mdh进行发酵条件优化,甘露醇质量浓度达到45.19 g/L,总糖转化率为37.66%。【结论】与乳酸菌利用蔗糖发酵生产甘露醇相比,产量提高了6倍,且具有发酵周期短、稳定性高等优点,菌株的成功构建为甘露醇工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 蔗糖水解酶 甘露醇脱氢酶 基因克隆 大肠杆菌
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芹菜甘露醇脱氢酶基因的分离与表达分析 被引量：6
3
作者 谭国飞 王枫 +2 位作者 贾晓玲 李岩 熊爱生 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期2189-2198,共10页
以芹菜(Apium graveolens L.)本芹品种‘六合黄心芹’和西芹品种‘文图拉’为研究对象,通过克隆测序,分别获得2种芹菜的甘露醇脱氢酶基因序列。2种芹菜来源的该基因全长均为1 098 bp,编码365个氨基酸,预测2种芹菜该酶蛋白质分子量分别为... 以芹菜(Apium graveolens L.)本芹品种‘六合黄心芹’和西芹品种‘文图拉’为研究对象,通过克隆测序,分别获得2种芹菜的甘露醇脱氢酶基因序列。2种芹菜来源的该基因全长均为1 098 bp,编码365个氨基酸,预测2种芹菜该酶蛋白质分子量分别为39.66 kD和39.69 kD,pI值分别为6.79和6.78。2种芹菜中甘露醇脱氢酶基因之间有17个核苷酸位点不同,3个氨基酸位点发生改变。通过与其他植物甘露醇脱氢酶基因与氨基酸序列比对,表明该基因具有高度的保守性。进化分析显示,与同属于伞形科的植物香芹进化关系最近。实时定量PCR表明,芹菜中甘露醇脱氢酶基因在根、茎、叶、花中表达有差异,其中根中含量最高。对2种芹菜分别进行4℃、38℃、0.2 mol·L-1NaCl和20%PEG处理7个不同时间段,实时定量表达分析显示,‘六合黄心芹’中甘露醇脱氢酶基因变化大于西芹‘文图拉’,且不同处理后甘露醇脱氢酶基因表达响应呈现出较大的差异。 展开更多
关键词 芹菜 甘露醇脱氢酶 基因克隆 非生物胁迫 表达
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利用代谢工程构建D-甘露醇生产菌株 被引量：4
4
作者 王小芳 陈晶 +3 位作者 刘萍萍 徐洪涛 郁彭 张学礼 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1450-1462,共13页
D-甘露醇广泛应用于食品、制药、化学品工业等领域。从野生型大肠杆菌出发,将来自假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291菌株的甘露醇脱氢酶与果糖转运蛋白编码基因整合到大肠杆菌ATCC8739的染色体中,并失活其他的... D-甘露醇广泛应用于食品、制药、化学品工业等领域。从野生型大肠杆菌出发,将来自假肠膜明串珠菌Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291菌株的甘露醇脱氢酶与果糖转运蛋白编码基因整合到大肠杆菌ATCC8739的染色体中,并失活其他的发酵途径(丙酮酸甲酸裂解酶、乳酸脱氢酶、富马酸还原酶、乙醇脱氢酶、甲基乙二醛合成酶和丙酮酸氧化酶),构建了一株遗传稳定的D-甘露醇生产菌株。使用无机盐培养基和葡萄糖果糖作为混合碳源,厌氧发酵6 d,D-甘露醇产量达1.2 mmol/L。基于细胞生长和D-甘露醇合成的偶联,进一步通过代谢进化技术提高细胞合成D-甘露醇的生产能力。经过80代的驯化,D-甘露醇产量提高了2.6倍,甘露醇脱氢酶的活性提高了2.8倍。构建获得的遗传稳定的工程菌能直接发酵糖生产D-甘露醇,不需添加抗生素、诱导剂和甲酸,在工业化生产时有一定优势。 展开更多
关键词 D-甘露醇 代谢进化 甘露醇脱氢酶 大肠杆菌
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甘露醇磷酸化酶基因的敲除对D-甘露醇合成的影响 被引量：3
5
作者 赵雅童 何光明 +3 位作者 瓮茹茹 石爱琴 路福平 李玉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期118-124,共7页
为了探究甘露醇分解利用途径对甘露醇合成的影响,在重组菌株R1(K-12/pTrc99a-mdh)的基础上,通过CRISPR/Cas9 敲除E.coli PTS 系统中的cmtA、cmtB、mtlA 基因,阻断了E. coli K-12 中甘露醇的分解途径,获得了重组菌株R3(K-12/ΔcmtAΔcmtB... 为了探究甘露醇分解利用途径对甘露醇合成的影响,在重组菌株R1(K-12/pTrc99a-mdh)的基础上,通过CRISPR/Cas9 敲除E.coli PTS 系统中的cmtA、cmtB、mtlA 基因,阻断了E. coli K-12 中甘露醇的分解途径,获得了重组菌株R3(K-12/ΔcmtAΔcmtBmdh^+)和R5(K-12/ΔcmtAΔcmtBΔmtlAmdh^+)。与出发菌株R1 相比,R3 的生长速率没有降低,而R5 的生长速率明显下降。并且R5 在以甘露醇为唯一碳源的培养基上已无法生长,说明cmtA、cmtB、mtlA 三个基因全部敲除后,菌株已无法再利用甘露醇作为碳源进行生长。最后,构建的重组菌株R5,测得MDH 酶活力为258 U/mL,用高效液相色谱对胞外产物进行检测,可检测到少量的甘露醇,为进一步探究大肠杆菌合成甘露醇的调控机制奠定基础。 展开更多
关键词 基因敲除 甘露醇 甘露醇脱氢酶 NADH
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NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的重组表达及甘露醇的转化条件 被引量：3
6
作者 封志媚 赵雅童 +2 位作者 刘业学 路福平 李玉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期186-191,共6页
对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析,为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-mdh,对其进行诱导发酵后,通过His标签对目的蛋白进行纯化,并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱... 对NADPH依赖的甘露醇脱氢酶的异源表达和对果糖的转化情况进行分析,为在细胞内构建甘露醇的合成途径奠定基础。构建重组菌株BL21(DE3)/p ET28a-mdh,对其进行诱导发酵后,通过His标签对目的蛋白进行纯化,并利用HPLC分析纯化后的甘露醇脱氢酶转化果糖生成甘露醇的情况。成功构建了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶重组表达菌株BL21(DE3)/p ET28amdh,并对表达后的甘露醇脱氢酶进行了纯化,测得纯化后的甘露醇脱氢酶酶活力为270 U/m L。对酶法转化果糖得到甘露醇的转化条件进行优化,确定最佳的转化条件为:当底物浓度为300 g/L,反应初始p H5.8,温度40℃,NADPH终浓度为9 mmol/L时,甘露醇转化率可以达到97.4%。实现了NADPH依赖的甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中的活性表达,为进一步研究大肠杆菌合成甘露醇的代谢调控提供了依据。 展开更多
关键词 甘露醇脱氢酶 NADPH 甘露醇 大肠杆菌 纯化
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假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达 被引量：2
7
作者 程雅韵 王新 +3 位作者 郑琳 李官浩 崔虎山 金清 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第13期153-156,共4页
利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase,MDA)基因的结构基因,克隆入表达载体p ETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒p ETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳... 利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶(mannitol dehydrogenase,MDA)基因的结构基因,克隆入表达载体p ETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒p ETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 k D;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。 展开更多
关键词 甘露醇 甘露醇脱氢酶 假肠膜明串珠菌 基因克隆 表达
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柠檬明串珠菌甘露醇脱氢酶特性研究 被引量：1
8
作者 王新 白琴琴 +2 位作者 李志华 李冬梅 金清 《食品工业》 CAS 北大核心 2014年第10期174-176,共3页
甘露醇在食品、医药和化工等行业有着广泛应用,柠檬明串珠菌发酵过程中在甘露醇脱氢酶催化下将果糖转化为甘露醇,是生产甘露醇的重要菌种。以柠檬明串株菌J17和E28为试验菌种,分别采用分光光度法和TLC薄层层析法检测粗酶液的活性和甘露... 甘露醇在食品、医药和化工等行业有着广泛应用,柠檬明串珠菌发酵过程中在甘露醇脱氢酶催化下将果糖转化为甘露醇,是生产甘露醇的重要菌种。以柠檬明串株菌J17和E28为试验菌种,分别采用分光光度法和TLC薄层层析法检测粗酶液的活性和甘露醇生成量。结果表明,J17所产甘露醇脱氢酶在发酵时间为12 h、温度为33℃、pH为6.0时活性最高,为0.11 U/mL。E28在发酵时间为16 h、温度为33℃、pH为6.5时,甘露醇脱氢酶活性最高,为0.12 U/mL。以甘露醇标准样作为对照,产生的甘露醇最大量接近1%。 展开更多
关键词 柠檬明串珠菌 甘露醇脱氢酶 发酵 甘露醇
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来源于P.bacterium 1109的甘露醇脱氢酶的重组纯化及酶学性质研究 被引量：1
9
作者 逯付之 徐炜 +3 位作者 吴昊 张文立 光翠娥 沐万孟 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第19期137-143,165,共8页
本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该... 本文将来自P.bacterium 1109的甘露糖醇脱氢酶(MDH)表达并提取纯化,研究了该重组酶的酶学性质及其在甘露醇生产中的工艺条件。结果显示重组MDH是一个相对分子量为37 kDa的四聚体。氨基酸序列比对发现其与大多数MDHs的同源性小于40%。该酶的最适pH和温度分别为8.5和80℃,且当金属离子Zn^(2+)存在时,重组MDH的活力提高到对照组的260%。此外,重组MDH在75℃孵育6 h后仍可保留超过85%的残留活性,热稳定性较高,比大多数MDHs的活性高。底物特异性研究表明其对D-果糖具有较高的专一性。重组MDH催化D-果糖的米氏常数(K_m)和催化效率(k_(cat)/K_m)分别为20 mmol/L和7.5 L/(mmol·min)。重组MDH在以400 mmol/L的D-果糖为底物的反应系统中,可将80%以上的D-果糖转化为甘露糖醇。通过对反应条件的优化,为后续工业化生产制备甘露醇奠定了基础。 展开更多
关键词 甘露醇 甘露醇脱氢酶(MDH) P.bacterium 1109 热稳定性 大肠杆菌BL21(DE3)
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