血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立 被引量：11

1

作者 王兰 饶春明 +2 位作者 李永红 高凯 王军志 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2009年第9期895-897,906,共4页

目的建立血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）生物学活性检测方法。方法利用HEK293/D9/Flt-18R（al-pha）/Flt-IL18R（beta）,clone V3H9细胞系,通过荧光素酶检测系统（Steady-Glo Luciferase Assaysystem）进行VEGF Trap的生物学活性... 目的建立血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）生物学活性检测方法。方法利用HEK293/D9/Flt-18R（al-pha）/Flt-IL18R（beta）,clone V3H9细胞系,通过荧光素酶检测系统（Steady-Glo Luciferase Assaysystem）进行VEGF Trap的生物学活性检测,用VEGF Trap参考品计算供试品的相对百分效价,并对该方法进行精密性和准确性验证。结果VEGF Trap供试品及参考品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式：y=（A-D）/[1＋（X/C）^B]＋D。3批VEGF Trap原液和6批成品经3次测定,相对百分效价的平均值在（90.00±2.40）%～（116.77±16.50）%之间,变异系数均小于15%。1批VEGF Trap原液及成品经3次测定,回收率分别为（90.40±2.67）%和（117.20±18.12）%。结论已成功建立VEGF Trap生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为VEGFTrap生物学活性的常规检测方法。 展开更多

关键词 血管内皮生长因子抑制剂 生物学活性 荧光素酶检测系统

原文传递

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究 被引量：4

2

作者 谭文斌 聂怡玲 +4 位作者 郭小珊 谭运年 成光杰 陈汉春 朱定尔 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第4期425-429,共5页

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( + 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ... 人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( + 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 。 展开更多

关键词 人干细胞因子基因 序列分析 基因表达 转录调控

下载PDF 职称材料

基于报告基因的抗HER2单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立及应用 被引量：4

3

作者 刘春雨 王馨 +2 位作者 于传飞 徐刚领 王兰 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期51-61,共11页

目的:利用转基因细胞法建立抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单抗的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法:利用Jurkat-hF... 目的:利用转基因细胞法建立抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单抗的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法:利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,SKBR3细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BioGloTM Luciferase Assay system)进行抗HER2单抗的ADCC生物学活性检测,同时对试验条件进行优化及方法学验证,并将该检测方法用于不同类型的抗HER2单抗ADCC效应的评价。结果:抗HER2单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,方法经优化后确定靶细胞为SKBR3细胞,抗体稀释起始工作质量浓度为4 000 ng·mL^(-1),1∶4倍的稀释倍数,效靶比为15∶1,诱导时间为20 h。该方法具有良好的专属性;3次独立检测的板间、日间最大诱导倍数(fold of induction,FI)及半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)的RSD均小于10%; 4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(46.27±2.01)%、(71.18±1.55)%、(133.17±9.91)%以及(166.55±15.73)%;对应的回收率分别为(92.53±4.01)%、(94.91±2.07)%、(106.54±7.93)%、(111.04±10.48),RSD均小于10%,且该方法也适用于不同变性程度及各类抗HER2单抗的ADCC效应评价。结论:本研究利用转基因细胞法成功建立抗HER2单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗HER2单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。 展开更多

关键词 抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体 抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用 生物学活性 荧光素酶检测系统 报告基因

原文传递

鸡Piwil1基因启动子区转录调控元件的初步分析 被引量：1

4

作者 夏明秀 常国斌 +8 位作者 陈蓉 翟飞 戴爱琴 马腾 王洪志 徐璐 陈静 刘璐 陈国宏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1349-1354,共6页

旨在确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,预测转录因子结合位点,并探讨转录因子对家禽Piwil1基因核心启动子活性的影响。通过将Piwil1基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组体质粒,将重组体分别转染COS-7和GC-1细胞系,... 旨在确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,预测转录因子结合位点,并探讨转录因子对家禽Piwil1基因核心启动子活性的影响。通过将Piwil1基因启动子系列缺失片段插入到pGL3-basic载体,构建重组体质粒,将重组体分别转染COS-7和GC-1细胞系,使用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定Piwil1基因核心启动子活性调控区,并对调控区进行转录因子结合位点预测;对预测的转录因子NF-Y结合位点进行定点突变,构建重组体质粒,并通过双荧光素酶报告基因检测系统分析其对启动子活性的影响。狼山鸡Piwil1基因的-1 377^-268bp区域在COS-7和GC-1细胞中都有不同程度的启动活性,-221^+1bp启动子活性几乎完全丧失,在-268^-221bp区域有转录因子NF-Y结合位点,定点突变后启动子活性显著下降,认为转录因子NF-Y对启动子活性可能起着重要的调控作用。转录因子NF-Y为Piwil1基因核心启动子区的重要调控元件,为进一步研究Piwil1基因的转录调控机制奠定了理论基础。 展开更多

关键词 Piwil1基因 核心启动子 定点突变 双荧光素酶活性检测系统 NF-Y

下载PDF 职称材料

促血小板生成素模拟肽二联体连接肽的筛选 被引量：1

5

作者 王海晴 史彦斌 +3 位作者 支德娟 王亚军 李红玉 王燕萍 《药物生物技术》 CAS 2016年第2期99-102,共4页

比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(d TMP)的生物活性,筛选高生物活性d TMP的Linker设计。全基因合成4个d TMP基因,将片段克隆到p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-1/d TMP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3... 比较不同Linker连接的促血小板生成素模拟肽二联体(d TMP)的生物活性,筛选高生物活性d TMP的Linker设计。全基因合成4个d TMP基因,将片段克隆到p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-1/d TMP,筛选阳性目的克隆,转化大肠杆菌BL21(DE3),0.1 mmol/L IPTG诱导表达融合蛋白。超声细胞破碎仪破菌,Glutathione Sepharose 4 Fast Flow亲和层析获得GST-d TMP融合蛋白,凝血酶酶切,再次亲和层析除去GST标签,收集目的 d TMP肽片段,双荧光素酶法检测各目的肽片段的活性。通过实验,正确构建了4个不同的p GEX-4T-1/d TMP表达载体,经表达纯化得到了GST-d TMP融合蛋白,酶切后再次亲和层析纯化,并获得了相对分子质量与理论值3 920,3 640,3 610,3 430相符的4个d TMP肽片段,它们的活性大小依次为:d TMP-Linker3>d TMP-Linker4>d TMP-Linker1>d TMP-Linker2。实验发现,不同的连接肽显著影响d TMP肽片段的生物活性,该实验成功筛选到了活性较高的连接肽Linker3。 展开更多

关键词 促血小板生成素模拟肽 融合蛋白 原核表达 双荧光素酶检测 亲和层析 生物活性

原文传递

抗白介素-1β单克隆抗体生物学活性检测方法的建立 被引量：1

6

作者 刘春雨 徐刚领 +6 位作者 于传飞 张峰 王文波 李萌 陈伟 王兰 高凯 《中国新药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第17期1959-1962,共4页

目的:建立抗白介素-1β单克隆抗体(抗IL-1β单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用HEK293-NF-κb-luc细胞系,通过荧光素酶检测系统(Steady-GloLuciferase Assay System)进行抗IL-1β单抗的生物学活性检测,以抗IL-1β单抗参比品通过平... 目的:建立抗白介素-1β单克隆抗体(抗IL-1β单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用HEK293-NF-κb-luc细胞系,通过荧光素酶检测系统(Steady-GloLuciferase Assay System)进行抗IL-1β单抗的生物学活性检测,以抗IL-1β单抗参比品通过平行线分析的方法计算供试品相对效价,并对该方法进行精密性和准确性验证。结果:抗IL-1β单抗供试品及参比品该方法中均存在量效关系,在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。5批抗IL-1β单抗成品经3次测定,相对效价平均值在(84.57±3.46)%^(101.93±7.56)%之间,变异系数均小于10%。2批回收率样品经3次测定,回收率分别为(113.00±15.32)%和(108.53±23.51)%。结论:已成功建立抗IL-1β单抗生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为抗IL-1β单抗生物学活性的常规检测方法。 展开更多

关键词 抗IL-1β单克隆抗体 生物学活性 荧光素酶检测系统

原文传递

基于雌激素受体调节Nrf2-ARE通路的黄芩中抗氧化成分的筛选 被引量：12

7

作者 刘媛媛 刘陶 +4 位作者 吴玉梅 张晗 赵鑫 刘志东 李楠 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期822-827,共6页

目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活... 目的建立基于Nrf2-ARE通路的报告基因筛选模型,筛选黄芩中基于雌激素受体发挥抗氧化作用的活性成分。方法 ARE荧光素酶报告质粒p GL4. 37和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共同转染293T细胞。将黄芩中汉黄芩素、黄芩素、黄芩苷等3个主要活性成分和(或)雌激素受体(ER)特异性抑制剂加入Nrf2-ARE双荧光素酶报告基因系统,检测其是否通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。将筛选出的成分和(或) ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂加入Ha Ca T细胞中,验证是否通过ER影响Nrf2-ARE通路发挥抗氧化作用。结果黄芩苷(100μmol·L^(-1))可明显激活293T细胞中的Nrf2-ARE通路,诱导表达倍数为空白组的(1. 56±0. 01)倍(P <0. 01)。预给予ER抑制剂后,诱导表达倍数下降至(1. 02±0. 23)倍,抗氧化作用消失。分别预给予ER抑制剂、Nrf2-ARE通路抑制剂后,黄芩苷干预UVB损伤的Ha Ca T细胞中的ROS值明显上升,SOD值明显下降。结论黄芩苷可以通过ER影响Nrf2-ARE通路,发挥抗氧化作用。 展开更多

关键词 黄芩 抗氧化 Nrf2-ARE通路 植物雌激素受体 双荧光素酶报告基因系统 黄芩苷

下载PDF 职称材料

TGF-β1调控基质金属蛋白酶-20(MMP-20)启动子转录活性的研究 被引量：6

8

作者 韩婷婷 孙岩 +3 位作者 张娟娟 刘晓影 官秀梅 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2009年第5期251-255,共5页

目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD1... 目的:克隆MMP-20基因启动子序列,分析转化生长因子-β1对其转录活性的影响。方法:检索并分析MMP-20基因翻译起始点上游序列。利用PCR从小鼠基因组上扩增长度为2852bp的启动子序列,并与pMD18-T克隆载体连接。经酶切反应初步鉴定后,以pMD18-T-MMP-20为模板,利用PCR方法获得带酶切位点的MMP-20启动子片段(2842bp),并与pGL3-Basic载体连接。pGL3-MMP-20瞬时转染小鼠成釉细胞系(ALC)过夜后,在培养基中加入1ng/mLTGF-β1,12h后检测荧光素酶的活性。结果:经酶切反应和测序结果证实MMP-20启动子成功插入pGL3-Basic质粒。与pGL3-Basic质粒转染相比较,转染pGL3-MMP-20后荧光素酶活性明显增强;培养基中加入TGF-β1能促使pGL3-MMP-20荧光素酶活性进一步增强。结论:外源性MMP-20启动子在成釉细胞中被激活;TGF-β1能增强pGL3-MMP-20荧光素酶活性,提示釉质发育过程中,TGF-β1具有调节MMP-20基因表达的生物学功能。 展开更多

关键词 转化生长因子-Β1 基质金属蛋白酶-20 启动子 双荧光素酶报告系统

下载PDF 职称材料

MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响 被引量：6

9

作者 邱进 刘辉 +5 位作者 热孜宛古丽.伊敏 袁芳 许瑞 马玲 霍强 周勇 《新疆医科大学学报》 CAS 2017年第5期606-611,616,共7页

目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素... 目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C>T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P<0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356^-108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1生成;预测发现正常MEF2C基因启动子片段上� 展开更多

关键词 肌细胞增强因子2 启动子突变 单纯性先天性心脏病 双荧光素酶报告基因系统 维吾尔族人群

下载PDF 职称材料

miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化 被引量：4

10

作者 李登 沙明磊 +2 位作者 陈磊 赵圣 邵怡 《现代生物医学进展》 CAS 2018年第17期3201-3208,共8页

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以... 目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。 展开更多

关键词 miR-203 RAW264.7 双荧光素酶报告基因系统 巨噬细胞极化 TLR4-Myd88-NF-κB

原文传递

CACNB2基因多态性与原发性高血压的关联性研究 被引量：4

11

作者 孙倩 王欣 +6 位作者 黄颖 胡云良 唐疾飞 林燕 牛宇欣 王晓欧 杜兵 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期340-344,共5页

目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600... 目的探讨钙离子通道G2亚基基因（calciumchannelt72gene，CACNB2）多态性与温州汉族人群原发性高血压的相关性及应用荧光素酶报告基因技术检测rs7069292不同等位基因对基因表达的影响。方法收集原发性高血压患者637例，以血压正常者600名作对照，采用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因rs2228645、rs2357928、rs7069292、rs7099380、rs10764319和rs11014166共6个SNP位点进行分型。构建CACNB2基因5’上游-2831bp到-2460bp的rs7069292的侧翼序列的荧光素酶报告基因载体。结果高血压组rs7069292CT基因型频率及C等位基因频率高于正常对照组（5．20％vs．2．17％，2．59％vs．1．08％，均P〈0．05），分型未发现rs7069292CC基因型；含rs7069292C等位基因的启动子活性与T等位基因相比明显增高，差异有统计学意义（P〈0．05）；其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。结论CACNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压病有关联，T〉C变异可能是CACNB2基因功能表达的一个影响因子。 展开更多

关键词 原发性高血压 钙离子通道 单核苷酸多态性 双荧光素酶报告基因

原文传递

miR-191通过调控C/EBPβ转录影响猪前体脂肪细胞分化 被引量：4

12

作者 刘帅 宁小敏 +4 位作者 李美航 仇杨 李艳杰 董培越 杨公社 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2013年第2期165-176,共12页

对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方... 对实验室前期Solexa结果进行深入挖掘,结合生物信息学分析从不同发育阶段猪皮下脂肪组织差异表达的miRNAs中筛选出高丰度差异极显著的候选miR-191.采用腺病毒过表达miR-191,实时定量PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因检测等技术方法,初步研究miR-191对猪前体脂肪细胞分化的影响.结果发现,miR-191随着猪前体脂肪细胞的分化表达量逐渐增加.与对照组相比,过表达miR-191的猪前体脂肪细胞中miR-191转录本显著增加,并引起CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)、PPARγ和aP2的mRNA水平降低,抑制了猪前体脂肪细胞分化.同时,Western blot结果显示,与对照组相比过表达miR-191的猪前体脂肪细胞在48 h C/EBPβ蛋白水平下降了55%.更重要的是,通过TargetScan等算法正向筛选以及MicroInspector反向筛选联合获得miR-191候选靶基因,经双荧光素酶报告基因检测结果证实,miR-191可直接作用于C/EBPβ3′UTR,从而降低萤火虫荧光素酶活性.综上所述,miR-191可能通过抑制脂肪细胞分化早期标志基因C/EBPβ的表达,从而抑制了猪前体脂肪细胞的分化. 展开更多

关键词 miR-191 C EBPβ 猪前体脂肪细胞 表达谱 靶基因预测 腺病毒 双荧光素酶报告基因检测系统

下载PDF 职称材料

牛Sry启动子调控序列的鉴定 被引量：4

13

作者 韩凤桐 林秀坤 +2 位作者 刘娣 吴宁 廖冰 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第14期2996-3004,共9页

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息... 【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。 展开更多

关键词 牛 SRY 核心启动子 双荧光素酶报告基因分析系统

下载PDF 职称材料

B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测 被引量：3

14

作者 吴胜昔 陈永文 +2 位作者 朱广倍 费蕾 吴玉章 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第7期955-960,共6页

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞... 目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体,转染肝癌Hep G2细胞进行活性检测。方法 PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段,并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子,经双酶切和测序鉴定后,将重组子转染Hep G2细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒,分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染Hep G2后经报告基因检测,P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性,IFN-γ作用后启动子活性明显增强,而P88转染组IFN-γ作用后,荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。 展开更多

关键词 B7-H1 启动子 双荧光素酶报告基因检测 活性测定

下载PDF 职称材料

雄激素受体激动剂与拮抗剂高通量筛选细胞模型的构建 被引量：3

15

作者 王卓娅 傅强 +2 位作者 刘彩云 梁高卫 吴培诚 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期472-475,共4页

有效的雄激素受体(androgen receptor,AR)激动剂与拮抗剂,可上调或下调雄激素受体刺激反应,起到治疗相关疾病的作用。高通量细胞筛选模型的建立,可扩大AR激动剂与拮抗剂筛选范围,加快筛选速度。本研究通过构建人雄激素受体表达重组质粒p... 有效的雄激素受体(androgen receptor,AR)激动剂与拮抗剂,可上调或下调雄激素受体刺激反应,起到治疗相关疾病的作用。高通量细胞筛选模型的建立,可扩大AR激动剂与拮抗剂筛选范围,加快筛选速度。本研究通过构建人雄激素受体表达重组质粒pcDNA 3.1-h AR,并与受雄激素效应元件调控的报告基因质粒MMTV-LTR-Luc F-R共转染人胚胎肾细胞293T,构建基于双荧光素酶报告基因的AR激动剂与拮抗剂筛选高通量细胞模型。AR激动剂5α-双氢睾酮可诱导该细胞模型荧光素酶的产生,AR拮抗剂尼鲁他明可拮抗5α-DHT的刺激作用,糖皮质激素受体激动剂地塞米松对细胞模型荧光素酶的产生无作用。 展开更多

关键词 雄激素受体 激动剂 拮抗剂 双荧光素酶报告系统 高通量筛选

原文传递

转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用 被引量：3

16

作者 高书颖 李恩民 +2 位作者 杜则澎 陆晓峰 许丽艳 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期695-698,共4页

目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ez... 目的:明确转录因子Sp1和Sp3对食管癌细胞ezrin基因的表达调控作用。方法:将转录因子表达载体CMV-Sp1和CMV-Sp3分别转染食管癌EC109细胞,采用定量RT-PCR和Western blot技术检测过表达转录因子Sp1和Sp3对ezrinmR-NA和蛋白表达的影响;将ezrin基因启动子驱动的报告基因表达载体与内参照质粒pRL-TK和转录因子表达载体共转染EC109细胞,采用双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1和Sp3对ezrin基因启动子的激活作用以及这种激活作用是否依赖于ezrin基因的Sp1结合位点-75/-69。结果:过表达转录因子Sp1和Sp3显著提高EC109细胞ezrinmRNA和蛋白表达水平以及启动子活性。Sp1和Sp3增强ezrin基因启动子活性的作用位点不同,只有Sp1通过-75/-69位点调控ezrin基因启动子活性。结论:转录因子Sp1和Sp3可调控EC109细胞ezrin基因的表达。 展开更多

关键词 EZRIN基因 食管癌细胞 转录因子 双荧光素酶报告基因分析系统

下载PDF 职称材料

miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子基因表达的靶向调控作用 被引量：2

17

作者 余丹纯 聂玉强 +1 位作者 黄耀星 孙小娟 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2019年第1期48-51,共4页

目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCA... 目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCAM mRNA的表达情况,确定实验细胞株;通过PCR扩增合成含有miR-9结合位点的ALCAM mRNA 3'端非编码区(ALCAM 3'UTR)片段和在miR-9结合位点进行突变的ALCAM-mut mRNA 3'UTR,测序鉴定后将其克隆至报告基因载体psi CHECK-2质粒,分别命名为psi CHECK-2-ALCAM和psi CHECK-2-ALCAM-mut;分组转染重组质粒和miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达,SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting检测ALCAM mRNA及蛋白表达水平。结果生物信息学分析筛选发现miR-9可能靶向调控ALCAM; ALCAM mRNA在各胃癌细胞株中的表达量明显高于人正常胃黏膜GES-1细胞株,且SGC-7901细胞株ALCAM mRNA的表达量最高(P <0. 05),确定为实验细胞株;测序验证ALCAM 3'UTR和ALCAM-mut3'UTR经PCR扩增合成成功; psi CHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-9 mimics细胞组的相对荧光素酶活性较psi CHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-NC、miR-9 inhibitor细胞组或空白对照组明显降低(P <0. 05),且该组细胞ALCAM mRNA和蛋白的表达明显降低(P <0. 05);而psi CHECK-2-ALCAM-mut质粒共转染miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor细胞组的相对荧光素酶活性与空白对照组相比,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论在SGC-7901中,miR-9通过与ALCAM mRNA 3'UTR结合而负性调控ALCAM基因的表达。 展开更多

关键词 胃癌 双荧光素酶报告基因系统 逆转录聚合酶链反应 蛋白质印迹法 MIR-9 活化白细胞黏附分子

下载PDF 职称材料

棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2核心启动子区缺失分析 被引量：2

18

作者 严宇澄 武淑文 +1 位作者 杨亦桦 吴益东 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期825-831,共7页

CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制,对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1095～+... CYP9A17v2的过量表达与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性相关。为了研究CYP9A17v2表达调控机制,对CYP9A17v2核心启动子区域的功能进行了分析;构建了含荧光素酶报告基因和CYP9A17v2启动子不同长度缺失片段(-1095～+43)的重组质粒,转染Sf9细胞瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。功能分析结果表明:所有的7个缺失片段均具有启动子活性,-197～+43启动子区域的转录活性最高。在CYP9A17v2基因5′-调控区-197～-113区域内可能存在转录增强因子的结合位点,而在-1095～-197区域内可能存在转录抑制因子的结合位点。本研究为探索棉铃虫CYP9A17v2过量表达的转录调控机理奠定了重要基础。 展开更多

关键词 棉铃虫 细胞色素P450 CYP9A17v2 启动子 双荧光素酶报告基因系统 转录调控

下载PDF 职称材料

AP-2α对基质金属蛋白酶-20作用的研究 被引量：2

19

作者 赵娜 王玉民 +4 位作者 孙学玲 曲正 孙岩 张娟娟 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2012年第4期183-188,共6页

目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色... 目的:通过研究AP-2α转录因子对基质金属蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确AP-2α的功能,为研究AP-2α在釉质形成中的作用奠定基础。方法:利用RT-PCR法、双荧光素酶报告基因检测系统、染色体免疫共沉淀技术等来分析AP-2α与MMP-20启动子区域的转录调控能力。结果:小鼠成釉细胞转染AP-2αsiRNA后,成釉细胞中MMP-20 mRNA的表达水平显著上调。染色体免疫共沉淀结果显示,AP-2α可能通过与MMP-20启动子特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达。双荧光素酶报告基因检测显示预测结合位点突变后,AP-2α对MMP-20启动子的表达水平无显著影响。结论:AP-2α基因沉默可显著上调MMP-20的mRNA表达水平;而AP-2α过表达可显著抑制MMP-20活性。提示AP-2α转录因子与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP-20的表达水平。 展开更多

关键词 AP-2α转录因子 基质金属蛋白酶-20 RT-PCR 双荧光素酶报告基因检测 染色体免疫共沉淀

下载PDF 职称材料

人热休克因子1对抗增殖蛋白基因启动子转录调控的研究 被引量：2

20

作者 刘晓华 郭东升 +4 位作者 王新兴 张志清 战锐 王晓明 钱令嘉 《中国应用生理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期349-352,共4页

目的:研究人热休克因子1(hHSF1)对抗增殖蛋白(prohibitin)启动子转录活性的影响。方法:采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,将pcDNA3.1(+)-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共... 目的:研究人热休克因子1(hHSF1)对抗增殖蛋白(prohibitin)启动子转录活性的影响。方法:采用PCR方法扩增hHSF1全长编码序列,构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,将pcDNA3.1(+)-hHSF1和人prohibitin基因启动子表达载体pGL3-prohibitin共同转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统,检测双荧光素酶活性,分析hHSF1对抗增殖蛋白基因启动子的转录调控作用。结果:成功构建pcDNA3.1(+)-hHSF1真核表达载体,荧光素酶活性测定发现hHSF1明显上调pGL3-prohibitin转录。结论:hHSF1对prohibitin具有转录调控作用。 展开更多

关键词 PROHIBITIN hHSF1 转录调控 双荧光素酶报告基因检测系统

下载PDF 职称材料