核因子E2相关因子2过表达对间充质干细胞抗缺氧和抗凋亡能力的影响 被引量：2

1

作者 刘荣强 袁泽南 +2 位作者 吴小材 刘炜 汪国营 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期110-115,共6页

目的研究核因子E2相关因子2(Nrf2)对间充质干细胞(MSCs)的抗缺氧及抗凋亡能力的影响。方法将过表达Nrf2的重组质粒及辅助质粒转染人胚肾细胞(293FT),获得过表达Nrf2的高滴度慢病毒。MSCs分别转染过表达Nrf2慢病毒以及空载体慢病毒,构建... 目的研究核因子E2相关因子2(Nrf2)对间充质干细胞(MSCs)的抗缺氧及抗凋亡能力的影响。方法将过表达Nrf2的重组质粒及辅助质粒转染人胚肾细胞(293FT),获得过表达Nrf2的高滴度慢病毒。MSCs分别转染过表达Nrf2慢病毒以及空载体慢病毒,构建稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs(Nrf2过表达组)以及绿色荧光蛋白(GFP)-MSCs(对照组)。采用荧光显微镜观察两组细胞的绿色荧光表达情况。采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测两组细胞中Nrf2蛋白的表达水平。采用光学显微镜观察两组细胞的抗缺氧能力,采用流式细胞术检测两组细胞的抗凋亡能力。结果成功构建了稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs,Western Blot法检测结果显示Nrf2过表达组细胞的Nrf2蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.01)。缺氧处理15 h后,Nrf2过表达组的细胞活力明显高于对照组。流式细胞术检测表明Nrf2过表达组细胞的凋亡率为(30.9±1.4)%,明显低于对照组细胞的(61.3±1.3)%(P<0.05)。结论稳定过表达Nrf2的Nrf2-MSCs在低氧环境中具有一定的抗缺氧、抗凋亡能力。 展开更多

关键词 核因子E2相关因子2(Nrf2) 间充质干细胞(MSCs) 慢病毒载体 转染 质粒 凋亡 缺氧 流式细胞术 人胚肾细胞 缺血-再灌注损伤(IRI)

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介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定 被引量：2

2

作者 彭梅娟 郝春秋 +5 位作者 姜泓 谢玉梅 张岩 李羽 陈隆 白雪帆 《生物技术通讯》 CAS 2008年第3期350-352,共3页

目的:构建介导大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA... 目的:构建介导大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果:CTGF的短发夹RNA(shRNA)片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。 展开更多

关键词 结缔组织生长因子 慢病毒载体 转移质粒 肝纤维化

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Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定 被引量：1

3

作者 王彪 张炜强 +3 位作者 单秀英 刘照亮 郭国祥 庄福连 《医学综述》 2011年第20期3158-3161,共4页

目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL... 目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 促血管生成素2 慢病毒载体 质粒载体

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慢病毒敲减质粒pLKO.1-shDAPK1的构建及其对细胞凋亡的影响

4

作者 秦坤 徐绍业 +3 位作者 韩雨 闫建国 夏春波 邵晓云 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2022年第6期715-720,共6页

目的 构建敲减死亡相关蛋白激酶1(shDAPK1)基因的慢病毒质粒及稳转神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),并检测SH-SY5Y细胞中DAPK1敲减后对细胞凋亡的影响。方法 设计并合成特异性敲减DAPK1基因的上下游引物,将引物退火后与双酶切PLKO.1载体经T... 目的 构建敲减死亡相关蛋白激酶1(shDAPK1)基因的慢病毒质粒及稳转神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),并检测SH-SY5Y细胞中DAPK1敲减后对细胞凋亡的影响。方法 设计并合成特异性敲减DAPK1基因的上下游引物,将引物退火后与双酶切PLKO.1载体经T4连接酶连接、转化、提取质粒并进行DNA测序,获得重组正确的慢病毒干扰质粒pLKO.1-shDAPK1。将该重组的质粒与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞,72 h后收集慢病毒上清液,感染SH-SY5Y细胞,利用嘌呤霉素进行阳性筛选,得到稳定敲减DAPK1的SH-SY5Y细胞系。利用Western blot检测SH-SY5Y稳转细胞系中DAPK1蛋白以及用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)处理后的Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白表达水平,并应用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。结果 重组pLKO.1-shDAPK1质粒的测序比对结果正确,嘌呤霉素筛选后获得shDAPK1稳转SH-SY5Y细胞系(shDAPK1-SY5Y),该稳转细胞系中DAPK1蛋白表达水平与对照组相比显著下降,此外还上调了Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3蛋白的表达且流式检测结果显示该细胞系凋亡发生率明显下降。结论 成功构建了慢病毒敲减质粒pLKO.1-shDAPK1,并建立了DAPK1低表达的SH-SY5Y稳定感染细胞系,明显抑制了细胞凋亡。 展开更多

关键词 死亡相关蛋白激酶1 慢病毒 质粒构建 人骨髓神经母细胞瘤细胞 细胞凋亡

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TK基因慢病毒载体质粒的构建及慢病毒表达系统的建立 被引量：1

5

作者 林健 戴学军 +5 位作者 王伟民 徐如祥 姜晓丹 袁振华 曹晖 蒋立新 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 2007年第4期334-337,共4页

目的:构建人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的慢病毒载体质粒,并建立其慢病毒表达系统。方法:利用酶切分别获取目的基因TK片段及慢病毒pLenti6/V5载体片段,将目的基因插入载体相应酶切位点,构建pLenti6/V5-TK质粒。构建的重组质粒经... 目的:构建人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的慢病毒载体质粒,并建立其慢病毒表达系统。方法:利用酶切分别获取目的基因TK片段及慢病毒pLenti6/V5载体片段,将目的基因插入载体相应酶切位点,构建pLenti6/V5-TK质粒。构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定。利用慢病毒表达系统(ViraPowerTMLentiviral Ex-pression Systems),将重组质粒与包装系统质粒(pLP1,pLP2,pLP/VSVG)4质粒共转染293T细胞,48h后收集培养上清并感染大鼠胶质瘤细胞9L,抗稻瘟菌素(blasticidin,BSD)筛选9L/TK细胞。MTT方法测试更昔洛韦(ganci-clovir GCV)对体外培养的9L/TK细胞杀伤效果。结果与结论:构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达2.7×105转导单位(transducing units,TU)/ml。经BDS筛选的9L/TK细胞对GCV杀伤敏感。成功构建了TK基因慢病毒载体质粒pLenti6/V5-TK,并建立了其慢病毒表达系统。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 慢病毒载体 质粒 9L细胞

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重组人成纤维细胞生长因子21慢病毒质粒的构建及鉴定 被引量：1

6

作者 陈瑜 徐丽兰 +6 位作者 杨建波 马开利 和占龙 马进 李鸿钧 吴正存 鲁帅尧 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第7期677-681,共5页

目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒... 目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染KMB17靶细胞。荧光显微镜观察293T细胞中报告基因EGFP的绿色荧光,判断重组慢病毒的感染效率;RT-PCR法检测KMB17靶细胞中h FGF21基因m RNA的转录;免疫荧光和Western blot法检测KMB17靶细胞中h FGF21蛋白的表达。结果重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21经双酶切及测序鉴定,证明构建正确,在包装细胞中获得较高的转染效率,重组慢病毒感染KMB17靶细胞72 h后,荧光显微镜下可见EGFP绿色荧光。感染组KMB17靶细胞中存在h FGF21基因m RNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了重组慢病毒质粒PLV-EF1aEGFP[2A]Puro-h FGF21,并于KMB17靶细胞中表达,为FGF21功能与特性的相关研究及基因工程药物的探索和研发奠定了基础。 展开更多

关键词 人成纤维细胞生长因子21 慢病毒质粒 KMB17细胞

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介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定 被引量：1

7

作者 陈志强 胡威 +5 位作者 叶章群 夏宗禹 马杰锋 夏丁 朱珉 陈刚 《临床泌尿外科杂志》 北大核心 2010年第9期701-703,707,共4页

目的:构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆... 目的:构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法:以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰(RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果:Ppif的短发夹RNA(shRNA)片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论:构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。 展开更多

关键词 Ppif基因 慢病毒载体 转移质粒

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人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建 被引量：1

8

作者 王博涵 余虓 +4 位作者 余淦 李恒 肖巍 徐华 叶章群 《中国组织工程研究》 CAS CSCD 2013年第7期1238-1242,共5页

背景:KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细... 背景:KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT-PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论:重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。 展开更多

关键词 组织构建 组织构建细胞学实验 慢病毒载体 KLF4基因 基因重组 5637细胞 载体质粒 DNA测序 组织工程 泌尿系肿瘤 大肠杆菌 DH5a感受态细胞 国家自然科学基金 组织构建图片文章

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人CYP39A1基因过表达慢病毒载体构建及其在HepG2中表达

9

作者 李丹 余涛 +4 位作者 徐庆雪 封时 张旭 张勇刚 曾智 《生物技术》 CAS 2021年第6期534-539,共6页

[目的]构建人CYP39A1基因过表达慢病毒载体,并建立CYP39A1基因过表达的HepG2细胞株,为研究CYP39A1在肝细胞肝癌中的作用机制奠定基础。[方法]构建具有嘌呤霉素抗性的CYP39A1慢病毒载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,包装成重组慢病毒颗粒... [目的]构建人CYP39A1基因过表达慢病毒载体,并建立CYP39A1基因过表达的HepG2细胞株,为研究CYP39A1在肝细胞肝癌中的作用机制奠定基础。[方法]构建具有嘌呤霉素抗性的CYP39A1慢病毒载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,包装成重组慢病毒颗粒;用嘌呤霉素筛选获得CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞,采用qPCR和Western Blot检测CYP39A1的mRNA和蛋白相对表达量。[结果]成功扩增CYP39A1基因片段,大小为1451 bp。确定嘌呤霉素在HepG2中的最佳筛选浓度为2.0μg/mL,目的基因CYP39A1被慢病毒成功导入HepG2细胞中,荧光显微镜下能直接观察到EGFP。成功构建CYP39A1过表达及其阴性对照病毒,CYP39A1过表达病毒滴度为1.0×10^(9) TU/mL,阴性对照病毒的滴度为3.0×10^(8) TU/mL。转染CYP39A1过表达组和阴性对照组的qPCR实验结果显示:在HepG2细胞中,过表达组的CYP39A1的mRNA表达量为阴性对照组的516.55±85.24倍(P<0.001)。Western Blot也显示有Flag-CYP39A1的蛋白过表达。[结论]成功构建CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞株,且CYP39A1的过表达组mRNA和蛋白均有上调。可为进一步探讨CYP39A1基因在肝细胞肝癌发生发展中的作用提供工具。 展开更多

关键词 CYP39A1基因 慢病毒质粒 HEPG2细胞 肝细胞肝癌

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靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

10

作者 周艳 解裕萍 +3 位作者 吴晋元 闫姗姗 张磊 李鸿钧 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第1期7-12,共6页

目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、sh... 目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 MA104细胞 多聚嘧啶序列结合蛋白 慢病毒质粒 RNA干扰

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Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定

11

作者 郑厚兵 单秀英 +4 位作者 刘照亮 王彪 郭国祥 张炜强 庄福连 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第24期2969-2973,共5页

目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产... 目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。 展开更多

关键词 RNA干扰 促血管生成素2 TIE2受体 慢病毒载体 质粒载体

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人BRCA1干涉慢病毒载体的构建与验证

12

作者 张永平 赵虎 +2 位作者 韦伊芳 张健 药立波 《现代生物医学进展》 CAS 2012年第17期3201-3204,共4页

目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接... 目的:设计合成干涉BRCA1表达的小干扰RNA,并克隆入pLKO.1慢病毒表达载体,为研究基因BRCA1在乳腺癌细胞增殖中的作用提供基础。方法:根据人BRCA1的基因序列,设计合成三对BRCA1干涉片段(序列前后加入酶切位点EcoRI和AgeI),再利用酶切连接反应将其插入到慢病毒载体pLKO.1中,经过酶切鉴定及测序正确后,将重组质粒转染入MCF-7细胞,48h后提取蛋白质和RNA,通过蛋白印迹验证BRCA1的蛋白水平的表达情况,Realtime PCR验证BRCA1的RNA水平的表达变化。结果:重组质粒经酶切鉴定和测序比对完全正确,转染乳腺癌细胞48h后可见BRCA1表达的明显下调。结论:成功构建BRCA1干涉的慢病毒载体,并且转染MCF-7细胞证实其能够下调BRCA1的表达,为后续研究BRCA1在乳腺癌细胞的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 BRCA1 慢病毒载体 干涉 重组质粒

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人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立

13

作者 支蕾 宋娟 +1 位作者 姚智 杨洁 《天津医科大学学报》 2013年第3期169-173,259,共6页

目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系。方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-... 目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系。方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒。将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒。收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株。荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平。结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90%以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低。结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础。 展开更多

关键词 人类P100蛋白 慢病毒载体 质粒 白血病 RNA干扰

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慢病毒法建立稳定表达HPV-16 E6癌蛋白的肺癌细胞株

14

作者 冯芸 丰晓威 +5 位作者 刘锦华 刘飞 李祥勇 兰柳波 陈小谊 唐旭东 《广东医学院学报》 2014年第2期129-133,共5页

目的方法结果结论(HPV)-16 E6DNA HPV-16 E6(PLIG)(PLIG-E6)293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用... 目的方法结果结论(HPV)-16 E6DNA HPV-16 E6(PLIG)(PLIG-E6)293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用重组技术将基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体中,获得重组慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定正确后,与慢病毒包装载体一起转染细胞,收集病毒液,测定滴度后,感染肺癌细胞株。经筛选培养周后,提取细胞基因组和蛋白,分别用和方法分析细胞中和蛋白的表达。双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功;感染慢病毒液的细胞中可检测出和蛋白表达。用慢病毒法成功构建稳定高表达癌蛋白的肺癌细胞株。 展开更多

关键词 HPV-16 E6 慢病毒方法 肺癌 质粒

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表达hCD4和hCCR5基因的慢病毒载体的构建

15

作者 李雅婧 诸葛福艳 +3 位作者 梁娟 何金洋 谭宁 曾常春 《华夏医学》 CAS 2016年第5期6-11,共6页

目的:构建一种高效转染h CD4和h CCR5基因的慢病毒载体。方法:应用Gateway技术构建可表达h CD4和h CCR5的质粒载体PLA.Ex Bi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5,并进行酶切和测序鉴定,进行慢病毒包装,用q RT-PCR方法检测293T细胞中h CD4/CCR5的m... 目的:构建一种高效转染h CD4和h CCR5基因的慢病毒载体。方法:应用Gateway技术构建可表达h CD4和h CCR5的质粒载体PLA.Ex Bi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5,并进行酶切和测序鉴定,进行慢病毒包装,用q RT-PCR方法检测293T细胞中h CD4/CCR5的m RNA表达。将本慢病毒载体转染于小鼠白血病细胞L615,应用q RT-PCR检测细胞内h CD4/CCR5 m RNA的表达及对HIV-1的易感性。结果:成功构建PLA.Ex Bi.P/puro-CMV-CD4-IRES-CCR5质粒表达载体,包装成的慢病毒载体在293T细胞中具有h CD4/CCR5 m RNA水平的高表达(P<0.05);转染于L615细胞亦表现出h CD4/CCR5 m RNA水平的高表达(P<0.05),并具备了HIV-1入胞感染的特点。结论:成功建立h CD4和h CCR5基因双启动的慢病毒载体,可使目的细胞高效表达h CD4及h CCR5分子,对HIV-1宿主细胞的制备、HIV/AIDS的发病机制和抗病毒研究具有积极的意义。 展开更多

关键词 慢病毒载体 H CD4/h CCR5 质粒 基因表达

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小鼠TRAF6特异性shRNA慢病毒质粒的构建及活性

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作者 谢琪璇 罗峰 +2 位作者 秋山泰身 井上纯一郎 秦俊文 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期20-24,共5页

目的:构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒。方法:设计、合成小鼠TRAF6基因特异性shRNA核苷酸,将其链接入pENTR/U6载体,基因测序;通过LR克隆酶将pENTR/U6中的TRAF6特异性shRNA核苷酸插入CS-RfA-EG慢病毒载体,KpnⅠ限制酶切分析;通... 目的:构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒。方法:设计、合成小鼠TRAF6基因特异性shRNA核苷酸,将其链接入pENTR/U6载体,基因测序;通过LR克隆酶将pENTR/U6中的TRAF6特异性shRNA核苷酸插入CS-RfA-EG慢病毒载体,KpnⅠ限制酶切分析;通过慢病毒将TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒导入MEF13细胞中,FACS分析质粒导入率,同时利用Western blot技术检测MEF13细胞中TRAF6的表达以及磷酸化IκBα的表达。以LacZ基因特异性shRNA慢病毒质粒为对照。结果:构建的小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒与设计相符;MEF13细胞中慢病毒质粒的导入率为95%以上;与对照组比较,TRAF6基因特异性shRNA可长期、完全抑制MEF13细胞中TRAF6的表达及TRAF6介导的IκBα的磷酸化。结论:成功构建小鼠TRAF6基因特异性shRNA慢病毒质粒。 展开更多

关键词 TRAF6 慢病毒质粒 SHRNA RNAI

原文传递

慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF的构建及鉴定

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作者 蔡艺煌 邓小玲 +3 位作者 黄文霞 黄洁 纪晴 许铭炎 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2018年第3期234-238,共5页

目的:构建敲减人血清反应因子SRF基因的慢病毒质粒,为进一步研究SRF在口腔鳞状细胞癌中的作用提供工具。方法:利用Thermo Fisher公司RNAi网站设计出针对SRF基因特异性敲减的片段,然后通过对pLKO.1载体进行双酶切,胶回收纯化后,经T4连接... 目的:构建敲减人血清反应因子SRF基因的慢病毒质粒,为进一步研究SRF在口腔鳞状细胞癌中的作用提供工具。方法:利用Thermo Fisher公司RNAi网站设计出针对SRF基因特异性敲减的片段,然后通过对pLKO.1载体进行双酶切,胶回收纯化后,经T4连接酶将双酶切线性化载体与设计的目的片段进行连接,转化和质粒提取,采用双酶切以及测序的方法对重组质粒进行序列鉴定。利用293T细胞对构建正确的pLKO.1-hSRF质粒进行病毒包装后感染SAS口腔鳞癌细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定株,并通过Western blot和实时荧光定量PCR对稳定转染细胞株的敲减效率进行验证。结果:构建出的慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF经测序和酶切鉴定均正确,感染该慢病毒质粒的SAS细胞后,其SRF蛋白表达量和mRNA水平与对照组相比均显著下降(P<0.01)。结论:慢病毒敲减质粒pLKO.1-hSRF构建成功,获得SRF低表达的SAS细胞株。 展开更多

关键词 慢病毒载体 质粒构建 血清反应因子 口腔鳞癌细胞

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p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

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作者 张春 苏丛 +1 位作者 伍婷 朱立雨 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期398-402,共5页

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10... 目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。 展开更多

关键词 P62 慢病毒载体构建 三质粒包装系统 THP-1细胞 肺炎克雷伯菌 过表达

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含绿色荧光蛋白的慢病毒载体的构建及表达 被引量：2

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作者 李振宇 徐开林 +3 位作者 潘秀英 鹿群先 主鸿鹄 何徐彭 《徐州医学院学报》 CAS 2004年第2期95-98,共4页

目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基... 目的　构建以泛醌启动子 (PUB)驱动绿色荧光蛋白 (GFP)表达的慢病毒载体三质粒表达系统 ,并建立其包装细胞系获得GFP的表达。方法　载体的构建采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法。三质粒系统中 ,转移质粒含PUB启动子及标志基因GFP ,包装质粒为ΔNRF ,内含CMV启动子和来自胰岛素基因的Poly(A)位点 ,包膜蛋白质粒编码水疱性口炎病毒G糖蛋白 (VSV -G)。载体构建成功后 ,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的包装细胞——— 2 93T ,12h后在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达情况。转染后 72h收集病毒上清 ,采用 6孔板培养感染细胞 ,荧光显微镜计数GFP阳性细胞法测定病毒滴度。结果　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的质粒pXZ5。转染 2 93T细胞后 12h在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光 ,证实了GFP的表达 ,成功构建了慢病毒载体的三质粒系统 ,建立了慢病毒载体的包装细胞系。 72h后 ,GFP的荧光强度较 12h增强 ,每一视野下 ,GFP表达阳性的细胞比例达 5 0 %左右。病毒浓度的测定在未进行超速离心浓缩的情况下达 2× 10 8U L。结论　成功构建了含PUB启动子驱动GFP表达的的慢病毒载体三质粒表达系统 ,转染2 93T细胞后获得了GFP的表达 。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 慢病毒载体 构建方法 基因表达 GFP 293T细胞

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神经束蛋白155高表达少突胶质细胞模型的构建 被引量：1

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作者 胡斌 王成举 +1 位作者 陈鹏慧 张雨平 《山东医药》 CAS 2019年第18期28-31,共4页

目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病... 目的构建神经束蛋白155(neurofascin155,NF155)高表达的少突胶质细胞模型。方法 RT-PCR法提取NF155 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与pUM-T simple重组,构建NF155慢病毒载体质粒,NheⅠ、AgeⅠ双酶切后,片段大小及基因测序均显示NF155慢病毒载体质粒构建成功。取对数生长期少突胶质细胞分为空白对照组、阴性慢病毒感染组、NF155慢病毒感染组,空白对照组不做任何处理,阴性慢病毒感染组予10 μL空载体慢病毒+100 μL培养基,NF155慢病毒感染组予10 μL慢病毒载体质粒+100 μL培养基。培养12 h采用荧光定量PCR法检测NF155 mRNA,采用Western blotting法检测NF155蛋白。结果 NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量分别为3.25±0.11、1.00±0.06、1.08±0.01,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155 mRNA相对表达量升高( P 均<0.05)。NF155慢病毒感染组、空白对照组、阴性慢病毒感染组NF155 蛋白相对表达量分别为1.57±0.08、0.51±0.12、0.50±0.06,与空白对照组、阴性慢病毒感染组比较,NF155慢病毒感染组NF155蛋白相对表达量升高( P 均<0.05)。结论 成功构建NF155高表达的少突胶质细胞瞬转细胞模型。 展开更多

关键词 神经束蛋白155 慢病毒载体质粒 神经束蛋白155慢病毒载体质粒 少突胶质细胞 脑白质损伤

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