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基于“遗传标志物”紫河车DNA指纹-试纸条分子鉴定方法及试剂的研究
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作者 王艳双 王艺潼 +1 位作者 母润红 张丽华 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1276-1284,共9页
目的:建立中药材紫河车遗传标志物DNA指纹-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发一体化质量控制基因检测试剂盒。方法:自主研发紫河车模板DNA提取的方法及试剂,根据人mtDNA cytb基因设计种属特异性引物,引物的5'端分别用FAM、Bio... 目的:建立中药材紫河车遗传标志物DNA指纹-免疫胶体金试纸条快速分子鉴定方法,研发一体化质量控制基因检测试剂盒。方法:自主研发紫河车模板DNA提取的方法及试剂,根据人mtDNA cytb基因设计种属特异性引物,引物的5'端分别用FAM、Biotin标记,筛选PCR最佳退火温度及循环次数,建立DNA指纹分子鉴定方法,研发PCR基因检测试剂预混液,采用分子克隆及基因测序技术制备对照药材DNA克隆液,利用免疫胶体金试纸条进行结果检测,开发出集“DNA提取试剂、PCR基因检测试剂预混液、对照药材DNA克隆液、空白对照液、试纸条”为一体的快速基因检测试剂盒,并进行特异性、重现性、灵敏性、稳定性的评价。结果:自主研发的DNA提取试剂提取的模板DNA质量浓度均在150~280 ng·μL^(-1),纯度均在1.8~1.9,琼脂糖凝胶电泳无拖尾。紫河车特异性引物在退火温度59℃、循环20次时;免疫胶体金试纸条显示:紫河车对照药材及正品出现2条红色条带,易混品及空白对照出现1条红的条带。琼脂糖凝胶电泳验证正确。对照药材DNA测序结果与人mtDNA cytb基因同源性100%。自主研发的一体化快速基因检测试剂盒的特异性强,重现性好,稳定性好,灵敏度为0.1 ng·μL^(-1)。结论:DNA指纹-免疫胶体金试纸条分子鉴定方法能够特异、准确、快速、可视化地对紫河车的真伪进行鉴定,一体化快速基因检测试剂盒为紫河车质量控制提供规范化、标准化的检测方式,更适合现场实地检测,可普遍推广使用。 展开更多
关键词 紫河车 遗传标志物 线粒体细胞色素B基因 PCR技术 DNA指纹 免疫胶体金试纸条 一体化试剂盒
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