用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素(英文) 被引量：13

1

作者 张爱联 罗进贤 +2 位作者 张添元 陈守才 官文俊 《Acta Genetica Sinica》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第6期552-557,共6页

为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9... 为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9K。将人血管抑制素 (AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点 ,获得含AS基因的重组质粒 pGAP9K AS。转化P .pastorisGS115 ,对获得的高拷贝转化子P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)进行组成型表达 ,同时以诱导型转化子P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)作为对照。SDS PAGE结果显示 :组成型转化子于培养 4d后AS的表达水平已达到高峰 ,分泌量为 5 8mg/L ;而诱导型转化子诱导 4d后表达的AS仅是组成型表达的 70 % ,诱导 6d后达到高峰 ,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时 (4d)的 86 %。CAM分析和抗癌实验结果显示 :P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)和P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C5 7BL/ 6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长 ,其平均瘤重抑制率分别达到 90 6 1%和 90 5 4 %。以上结果表明 ,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点 ,PGAP可以取代PAOX1在P .pastoris中表达AS及其他外源蛋白。 展开更多

关键词 组成型表达 人血管抑制素 毕节酵母 GAP启动子 抗血管生成 抗肿瘤

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人血管抑素基因工程菌发酵条件的初步研究 被引量：6

2

作者 卢文菊 罗进贤 +1 位作者 何建国 张添元 《广州医学院学报》 2000年第3期1-3,共3页

目的 :探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素 (rhAGN)的影响。方法 :应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及 pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果 :(1)工程菌E .coliDH5α(pBVA2 )在 30℃培养至A60 0nm... 目的 :探讨发酵条件对大肠杆菌工程菌表达重组人血管抑素 (rhAGN)的影响。方法 :应用摇瓶和发酵罐发酵试验观察不同诱导时机和诱导时间以及 pH、通气量等对rhAGN表达量的影响。结果 :(1)工程菌E .coliDH5α(pBVA2 )在 30℃培养至A60 0nm 为 0 .3～ 0 .5时于 4 2℃诱导4hrhAGN表达量最高 ,约为 2 12mg L ;(2 ) 15L发酵罐发酵参数为 pH7.2 ,搅拌转速 50 0r min ,通气量 4～ 8L min ,溶氧 50 %时 ,rhAGN表达量提高到 2 76mg L。结论 :确定了最适诱导时机和诱导时间 ,通过调节 pH和改善通气 ,初步形成了一套高表达rhAGN的发酵工艺。 展开更多

关键词 人血管抑素 基因表达 大肠杆菌 发酵

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人血管生成抑制素基因在大肠杆菌中的融合表达 被引量：5

3

作者 卢文菊 罗进贤 李文清 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期88-91,共4页

将人血管生成抑制素基因定向插入表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的ＢａｍＨⅠ位点，构建重组质粒ｐＥＴＡ２，转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．在ＩＰＴＧ诱导下，血管生成抑制素基因在重组转化株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＴＡ... 将人血管生成抑制素基因定向插入表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的ＢａｍＨⅠ位点，构建重组质粒ｐＥＴＡ２，转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）．在ＩＰＴＧ诱导下，血管生成抑制素基因在重组转化株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＥＴＡ２）中获得高效表达．表达产物以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的３７．２％．利用羊抗人纤溶酶原抗血清作为第一抗体。 展开更多

关键词 血管生成抑制素 基因表达 肿瘤 免疫疗法

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重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件 被引量：1

4

作者 邵玲莉 周楠迪 +2 位作者 吴奇凡 金坚 田亚平 《无锡轻工大学学报（食品与生物技术）》 CSCD 北大核心 2004年第2期8-11,共4页

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达... 对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L. 展开更多

关键词 人血管抑素 重组大肠杆菌 发酵条件 pQE32-AGN 产物表达

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人血管生成抑制素基因的克隆、表达载体构建及纯化

5

作者 黄梁 李彪 朱承谟 《上海医学》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期615-618,共4页

目的　克隆人血管生成抑制素基因 (angiostatin) ,纯化其表达蛋白并初步检测纯化蛋白的生物学活性。方法　用PCR技术从正常成人肝cDNA库扩增出人血管内皮抑素基因 ,将其克隆进 pBluescript中 ,测定其核苷酸序列。构建大肠杆菌分泌性表... 目的　克隆人血管生成抑制素基因 (angiostatin) ,纯化其表达蛋白并初步检测纯化蛋白的生物学活性。方法　用PCR技术从正常成人肝cDNA库扩增出人血管内皮抑素基因 ,将其克隆进 pBluescript中 ,测定其核苷酸序列。构建大肠杆菌分泌性表达载体 pET 2 2b(+) angiostatin 6×His,异丙基硫代 β D 半乳糖苷(IPTG)诱导表达 ,经Ni2 + IDASepharose 6B亲和纯化该表达蛋白 ,并采用血管内皮细胞增殖抑制实验检测其活性。结果　经PCR扩增成功获得 10 5 9bp的人血管生成抑制素基因 ,测序正确 ,在大肠杆菌中表达后 ,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的 10 %。SDS PAGE和WesternBlot显示其相对分子质量为 39× 10 3 。经亲和纯化后的angiostatin 6×His纯度可达 90 % ,得率为 0 .2 5mg/ 10 0ml,并且具有抑制血管内皮细胞增殖的活性 ,达到 5 0 %的抑制率 ,angiostatin 6×His浓度为 80 0ng/ml。 结论　人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化 。 展开更多

关键词 人血管生成抑制素 克隆 纯化 基因表达载体 生物学活性 新生血管 肿瘤

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不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠肾功能的影响 被引量：3

6

作者 李伟 应长江 林红晓 《徐州医学院学报》 CAS 2009年第7期428-430,共3页

目的探讨不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated viruscarrying human angiostatin gene,rAAV-AS)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾功能的影响。方法60只清洁级雄性SD大鼠随机抽取10... 目的探讨不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated viruscarrying human angiostatin gene,rAAV-AS)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠肾功能的影响。方法60只清洁级雄性SD大鼠随机抽取10只作为正常对照组(NC组),其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射链尿佐菌素(STZ)60 mg/kg,72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功,适应性喂养1周后,把糖尿病大鼠随机分为DN组(n=10),rAAV-0组(n=10),AS1组(n=10,1×1012VG/kg),AS2组(n=10,2×1012VG/kg),AS3组(n=10,4×1012VG/kg)。AS1组、AS2组和AS3组3组大鼠尾静脉注射rAAV-AS,NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水,rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起,整个实验过程共持续8周。8周后检测各组大鼠的体重(body weight,BW)、肾重(kidney weight,KW),计算肾指数(kidney in-dex,KI),检测血糖(blood glucose,BG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、尿微量白蛋白(miscroalbunminuria,MAU)。结果与NC组相比,DN、rAAV-0、AS1组的KI、MAU、BUN、SCr、BG、HbA1c明显增高(P<0.05);与DN组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr明显降低(P<0.05);与rAAV-0组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05);与AS1组相比,AS2组和AS3组KI、MAU、BUN、SCr降低(P<0.05)。结论中等剂量和大剂量rAAV-AS对DN大鼠肾脏具有保护作用,且不依赖血糖降低而起作用。 展开更多

关键词 糖尿病肾病 腺相关病毒载体介导的血管抑素 基因治疗

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重组人血管抑素(rhAGN)包涵体变性与复性初探

7

作者 田亚平 邵玲莉 金坚 《药物生物技术》 CAS CSCD 2005年第2期85-89,共5页

在优化的培养条件下,进行rhAGN5L罐发酵,菌体干重由原摇瓶发酵的3.02g/L增加到8.06g/L,表达量依然稳定在35%;对所产生的包涵体进行溶解变性研究,确定较佳变性缓冲液组成为8mol/L尿素,50mmol/LTrisHCl,20mmol/LDTT,pH值8.0;凝胶过滤色谱... 在优化的培养条件下,进行rhAGN5L罐发酵,菌体干重由原摇瓶发酵的3.02g/L增加到8.06g/L,表达量依然稳定在35%;对所产生的包涵体进行溶解变性研究,确定较佳变性缓冲液组成为8mol/L尿素,50mmol/LTrisHCl,20mmol/LDTT,pH值8.0;凝胶过滤色谱复性效果相对较好,蛋白浓度4.28μg/ml(IC50)时对HEMC细胞的抑制活性达50.1%。 展开更多

关键词 重组人血管抑素 包涵体 变性 复性

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重组人血管抑素的生物学活性研究 被引量：1

8

作者 杨炳华 何杨 +1 位作者 赵益明 金坚 《苏州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2010年第4期732-734,766,898,共5页

目的通过培养人微血管内皮细胞(HMEC-1)及建立鸡胚尿囊膜模型(CAM)观察重组人血管抑素(rhAS)的生物学活性。方法将不同浓度的rhAS加入含HMEC-1的培养瓶中,培养48h后,用MTT法检测其对细胞的抑制率;用乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性测定检测rhA... 目的通过培养人微血管内皮细胞(HMEC-1)及建立鸡胚尿囊膜模型(CAM)观察重组人血管抑素(rhAS)的生物学活性。方法将不同浓度的rhAS加入含HMEC-1的培养瓶中,培养48h后,用MTT法检测其对细胞的抑制率;用乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性测定检测rhAS诱导HMEC-1凋亡的作用;用CAM模型检测rhAS对血管的抑制作用。结果 rhAS在体外可显著抑制HMEC-1细胞的增殖;在体内则可明显抑制CAM上血管的生成。通过AchE活性测定,发现rhAS既可抑制HMEC-1细胞的增殖,也可诱导HMEC-1细胞凋亡,其作用的不同与rhAS剂量相关。结论 rhAS是一个较有前景的抗肿瘤血管药物。 展开更多

关键词 重组人血管抑素 人微血管内皮细胞 鸡胚尿囊膜模型 生物学活性

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人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

9

作者 张利芳 胡娴娴 +2 位作者 于洪涛 吕军 王惠琴 《包头医学院学报》 CAS 2006年第4期368-370,共3页

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PH IL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白。方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PH IL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern... 目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PH IL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白。方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PH IL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE(12%)和W estern b lot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定。结果:SDS-PAGE和W estern b lot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化。Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L。活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖。结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白。 展开更多

关键词 人血管抑素K1-3 PHIL—D2 毕赤酵母GS115 表达

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重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂制备及相关研究

10

作者 王芳 刘海俊 +3 位作者 李燕 丰玲玲 余惠芳 翁永德 《解放军药学学报》 CAS 2013年第4期337-339,共3页

目的制备重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂,并对制剂稳定性及刺激性进行考察。方法选择玻璃酸钠为赋形剂,苯扎氯铵为抑菌剂,EDTA-2Na为稳定剂组成适宜的重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂处方,按滴眼剂配制要求配制,以外观、理化性质、... 目的制备重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂,并对制剂稳定性及刺激性进行考察。方法选择玻璃酸钠为赋形剂,苯扎氯铵为抑菌剂,EDTA-2Na为稳定剂组成适宜的重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂处方,按滴眼剂配制要求配制,以外观、理化性质、含量等为考察指标,采用紫外光谱法及Draize法分别对其稳定性与刺激性进行评价。结果重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂为无色透明液体,制剂在低温条件下可稳定保存至少3个月,Draize评分<3分,其余各项指标符合国家标准。结论重组人Kringle 1-3血管抑素滴眼剂处方合理,性质较稳定,无刺激性。 展开更多

关键词 重组人Kringle1-3血管抑素 制备 稳定性 刺激性

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人血管抑素Kringles 1-3的表达纯化及生物学活性研究 被引量：2

11

作者 李壮林 姚雪静 原桂勇 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期24-28,共5页

人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。... 人血管抑素包含了4个环饼状结构域(Kringle),是一个有效的血管生成抑制因子。采用PCR方法从人胚肝cDNA文库中扩增了人血管抑素Kringles1-3的基因,重组于pPIC9K载体中,获得重组载体pPIC9K-K1-3,然后转化毕赤酵母细胞GS115,获得重组菌株。K1-3蛋白在5 L发酵罐的表达量达41.2 mg/L,发酵液上清经过浓缩、透析,然后用Lysine Sepharose 4B层析柱纯化,得到的K1-3蛋白纯度大于98%,纯化回收率达到95%以上。K1-3能明显抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移,达到抑制效果为50%时所需的蛋白浓度(IC50)为1.86μg/ml。K1-3也能抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长,抑制率达95%。为应用人血管抑素Kringles1-3治疗肿瘤奠定了初步实验基础。 展开更多

关键词 人血管抑素 表达 纯化 活性研究 毕氏酵母

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