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利用Rde/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒 被引量：10
1
作者 兰德松 石星明 +6 位作者 王云峰 刘长军 王玫 崔红玉 田国彬 李继松 童光志 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期78-84,共7页
【目的】本研究以火鸡疱疹病毒(HVT)BAC分子克隆为平台,构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒,以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术,经过两步法重组:第一步,用两端带有50bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL... 【目的】本研究以火鸡疱疹病毒(HVT)BAC分子克隆为平台,构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒,以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术,经过两步法重组:第一步,用两端带有50bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL-neo表达盒替换HVT基因组US2区;第二步,用两端带有同样的50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsL-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆,经卡那霉素抗性反向筛选和PCR进一步鉴定,鉴定正确的克隆命名为pHVT-HA。提取并纯化pHVT-HA DNA,转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),以完成重组病毒的拯救。【结果】命名为pHVT-HA3的BAC克隆转染CEF后第4天,出现病毒噬斑,噬斑形态与野生型HVT相似,获得拯救的重组病毒,命名为rHVT-HA3,将重组病毒rHVT-HA3在CEF上连续传代培养,经PCR和间接免疫荧光检测表明,重组病毒在连续传代过程中仍能稳定表达HA蛋白。【结论】本研究以HVT BAC为平台,利用Red/ET重组技术,构建了表达禽流感A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的血凝素(HA)基因的重组火鸡疱疹病毒,为新型禽流感重组活载体疫苗开发奠定基础。 展开更多
关键词 火鸡疱疹病毒 细菌人工染色体 Red/ET克隆 禽流感病毒 HA基因
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表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建 被引量：7
2
作者 李奇蒙 陈普成 +5 位作者 柳金雄 姜永萍 王笑梅 田雨 胡永浩 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期515-518,共4页
为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR方法扩增IBDV的VP2基因构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并采用限制性内切酶将携带Pec复合启动子和CMV增强子的VP2基因表达盒(Pec-VP2)切下,连... 为构建表达传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(rHVT-VP2),本研究利用RT-PCR方法扩增IBDV的VP2基因构建了重组真核表达质粒pCAGG-VP2,并采用限制性内切酶将携带Pec复合启动子和CMV增强子的VP2基因表达盒(Pec-VP2)切下,连接于Gateway系统入门质粒pENTR构建pENTR-VP2。采用Gateway LR克隆技术将pENTR-VP2与构建的重组粘粒f5354ccdBK+共同参与基因片段互换反应,构建重组粘粒f5354-VP2。f5354-VP2与其他4个相互重叠覆盖HVT全基因组的粘粒经酶切线性化后共同转染CEF细胞,并拯救出重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF细胞中连续传代20次,每隔5代采用PCR、western blot和间接免疫荧光进行检测,结果表明VP2蛋白均得到稳定地表达。rHVT-VP2的构建为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒 火鸡疱疹病毒 VP2
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基于CMV启动子表达鹦鹉热衣原体PmpD-N蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建
3
作者 刘杉杉 孙伟 +5 位作者 张稳 贾长青 罗杰 沈易华 郁建生 何诚 《动物医学进展》 北大核心 2018年第7期13-18,共6页
为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HV... 为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HVT重组病毒,并在体外评价该重组病毒的相关特性。结果表明,转染细胞后成功获得HVT重组病毒。通过Western blot和IFA分析表明,重组病毒表达了PmpD-N蛋白。Confocal分析表明,PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。HVT重组病毒的复制特性和野生型HVT一致。HVT重组病毒能够激活巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6和NO的产生。该试验成功构建了含有CMV启动子,能够表达PmpD-N蛋白的HVT重组病毒,为下一步进行动物试验和分析该病毒的免疫效力奠定了基础。 展开更多
关键词 鹦鹉热衣原体 多型外膜蛋白D的N端 火鸡疱疹病毒 细菌人工染色体技术 巨细胞病毒启动子
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火鸡疱疹病毒繁殖非必须基因重组病毒用转移载体的构建 被引量：1
4
作者 张凤珍 郝岗平 +3 位作者 边高鹏 史仁玖 张媛英 孙凌云 《泰山医学院学报》 CAS 2002年第4期367-369,共3页
目的　构建用于基因工程疫苗制作的火鸡疱疹病毒 (HVT)外源基因转移用载体。方法　利用PCR技术 ,从感染火鸡疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞 (CEF)基因组中成功地扩增出火鸡疱疹病毒的繁殖非必须基因 US基因 ,将该PCR产物克隆进PGEM T载体中 ... 目的　构建用于基因工程疫苗制作的火鸡疱疹病毒 (HVT)外源基因转移用载体。方法　利用PCR技术 ,从感染火鸡疱疹病毒的鸡胚成纤维细胞 (CEF)基因组中成功地扩增出火鸡疱疹病毒的繁殖非必须基因 US基因 ,将该PCR产物克隆进PGEM T载体中 ,利用末端平滑化技术和连接反应 ,把报告基因LacZ基因插入到US基因中。结果　构建出了用于制作重组HVT病毒的转移载体。结论　本研究以LacZ作为报告基因 ,成功的将其插入到US基因中 。 展开更多
关键词 火鸡疱疹病毒 繁殖非必须基因重组病毒 转移载体 US基因
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