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重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定
被引量：
1
1
作者
冯波
李青旺
+2 位作者
肖波
韩增胜
支旭勃
《安徽农业科学》
CAS
北大核心
2008年第2期457-459,511,共4页
[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂...
[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。
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关键词
人神经生长因子
β
基因克隆
腺病毒
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职称材料
人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定
被引量：
1
2
作者
马巍
刘淼
+1 位作者
杨广笑
王全颖
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2005年第1期33-36,42,共5页
目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性.方法将NGFβ目的基因亚克隆人表达载体pBV220的BamHI-BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达...
目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性.方法将NGFβ目的基因亚克隆人表达载体pBV220的BamHI-BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及PC12细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性.结果成功构建了重组质粒pBV220/NGFβ.使用该质粒转化DH5o宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS-PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中.通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的NGFβ.每升表达菌可以获得1.8～2.0 mg NGFβ.鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的NGFβ是具有生物活性的.它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105BU/g.结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白.
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关键词
人神经生长因子
分子亚克隆
原核表达
生物活性
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职称材料
题名
重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定
被引量：
1
1
作者
冯波
李青旺
肖波
韩增胜
支旭勃
机构
西北农林科技大学动物科技学院
燕山大学环化学院生物工程系
出处
《安徽农业科学》
CAS
北大核心
2008年第2期457-459,511,共4页
基金
河北省秦皇岛市科技局转基因动物生产基因工程药物研究项目(DO8)
文摘
[目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。[方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。[结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。[结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。
关键词
人神经生长因子
β
基因克隆
腺病毒
Keywords
hngf
-
β
gene
gene
cloning
Adenovirus
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定
被引量：
1
2
作者
马巍
刘淼
杨广笑
王全颖
机构
西安交通大学第一医院骨科
西安华广生物工程有限公司
出处
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2005年第1期33-36,42,共5页
文摘
目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子成熟蛋白基因片段(hNGFβ)并检测其生物活性.方法将NGFβ目的基因亚克隆人表达载体pBV220的BamHI-BamHI位点,连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株通过热诱导表达NGFβ蛋白,利用溶解包涵体和重折叠使表达产物复性,将复性后的蛋白质加入体外培养的鸡胚背根神经节及PC12细胞BrdU掺入实验,观察表达蛋白的生物学活性.结果成功构建了重组质粒pBV220/NGFβ.使用该质粒转化DH5o宿主菌,使用热诱导方法表达了NGFβ蛋白,SDS-PAGE结果提示表达蛋白主要存在于包涵体中.通过肝素亲和层析可以获得纯度大于90%的NGFβ.每升表达菌可以获得1.8～2.0 mg NGFβ.鸡胚背根神经节突起生长实验和PC12细胞培养生长刺激BrdU掺入实验表明原核表达的NGFβ是具有生物活性的.它的生物活性按生物制品鉴定章程判断为1×105BU/g.结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的NGFβ蛋白.
关键词
人神经生长因子
分子亚克隆
原核表达
生物活性
Keywords
hngf
β
gene
segment
encoding
mature
peptide
molecular
subcloning
prokaryotic
expression
bioactivity
分类号
R749.1 [医药卫生—神经病学与精神病学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定
冯波
李青旺
肖波
韩增胜
支旭勃
《安徽农业科学》
CAS
北大核心
2008
1
下载PDF
职称材料
2
人神经生长因子成熟蛋白基因片段在大肠杆菌中的表达和生物活性鉴定
马巍
刘淼
杨广笑
王全颖
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2005
1
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职称材料
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