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K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：8
1
作者 袁丽霞 饶明章 +7 位作者 张杰 赵子君 陈建 陈杨一骏 严立福 郑晓翠 谢暮晴 曹伟胜 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期1349-1356,共8页
为了研究K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法,以ALV-K GDFX0603株为模板,扩增其gp85基因,构建原核表达质粒p ET-GDFX0603-gp85,筛选原核表达菌液的诱导条件,采用Ni柱纯化表达的重组蛋白;以纯化后重组蛋白作为包被抗原,研究ALV-K抗... 为了研究K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法,以ALV-K GDFX0603株为模板,扩增其gp85基因,构建原核表达质粒p ET-GDFX0603-gp85,筛选原核表达菌液的诱导条件,采用Ni柱纯化表达的重组蛋白;以纯化后重组蛋白作为包被抗原,研究ALV-K抗体间接ELISA检测方法。结果显示,表达的gp85重组蛋白以包涵体形式存在,大小为53 ku。Western-blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫反应性;重复性试验结果显示,板内重复性的CV最大值为10.41%;板间重复性的CV最大值为12.57%,CV值均小于15%。特异性试验结果显示,该方法除了对ALV-A阳性血清有弱的交叉反应外,对ALV-B、ALV-J、AIV、NDV、IBDV、MDV、REV、大肠杆菌和沙门菌的阳性血清均无交叉反应。结果表明,初步建立了检测ALV-K抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的板内和板间重复性及较强的特异性。 展开更多
关键词 K亚群禽白血病病毒 gp85蛋白 原核表达 间接ELISA
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J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立 被引量：7
2
作者 刘丽娜 邵华斌 +5 位作者 程国富 杨峻 张琳 谢华丽 栗绍文 罗青平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期38-41,共4页
为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析... 为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析表明,重组蛋白gp85具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,该方法对其它相关的禽类病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均低于13%,具有良好的重复性。对458份临床血清样品进行检测,同时用IDEXX的同类ELISA抗体检测试剂盒进行对比,总符合率达到96.29%。本研究为ALV-J的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病 gp85基因 蛋白表达 酶联免疫吸附试验
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J亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备 被引量：6
3
作者 梁艺瑜 冯少珍 +5 位作者 史伟伟 刘红波 王小芬 李育豪 廖明 曹伟胜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第10期76-81,共6页
J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR... J亚群禽白血病病毒(ALV-J)在中国普遍存在,严重危害养禽业,暂时尚无有效预防、治疗禽白血病的措施,只能通过净化控制。因此,研究一种低成本、易推广的检测方法对防控此病非常重要。用DF-1细胞接种病毒,以细胞基因组为模板,通过巢式PCR方法扩增出941bp的含酶切位点的ALV-J特异性基因gp85基因序列,连接于pET32a(+)载体上,实现gp85蛋白在宿主菌BL21的表达,以切胶回收方式纯化蛋白,成功获得约52ku的重组融合蛋白,免疫新西兰兔,制备gp85单因子抗血清,Dot-ELISA检测抗体效价。结果显示,纯化所得蛋白质具有良好抗原性,制备的抗血清效价高于1.024×105。本试验通过较简便、低耗的方法获得高效单因子血清,为抗血清的制备提供参考,为ALV-J gp85蛋白的研究、ALV-J特异性检测方法的研制打下基础,对ALV-J的净化有重要意义。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒 单因子血清 gp85基因 蛋白表达
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禽白血病病毒gp85蛋白在293T细胞中的表达及分析 被引量：2
4
作者 葛成 张海龙 +4 位作者 焦贺静 李蕴玉 李佩国 张志强 张香斋 《中国家禽》 北大核心 2020年第1期34-37,共4页
为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(p... 为获得293T细胞表达的ALV-J gp85蛋白,研究通过PCR扩增ALV-J gp85基因,利用基因克隆技术克隆pMD-18T-gp85并测序,进而构建表达质粒p EGFP-N1-gp85。利用293T细胞对重组表达质粒进行表达,通过荧光显微镜和Western blot检测重组表达质粒(pEGFP-N1-gp85)的表达情况。结果显示,pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中均匀分布,说明pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达;pEGFP-N1-gp85重组表达质粒在293T细胞中表达的蛋白质分子质量约为60 ku。结果表明,成功构建了真核表达质粒pEGFP-N1-gp85,并在293T细胞中获得了表达,为研制ALV-J-gp85 DNA核酸疫苗提供了科学支撑。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒 gp85 囊膜蛋白 真核表达
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表达A亚群禽白血病病毒Gp85蛋白的乳酸菌的构建 被引量：1
5
作者 李鼎伟 高可丽 +4 位作者 曾扬 方春 杨玉莹 刘晶 梁雄燕 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第9期3456-3463,共8页
本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组... 本研究旨在构建乳酸菌表达载体以研制A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)的活菌疫苗,用于预防禽白血病。使用锚定表达载体构建2株分别表达gp85和gp85-DCpep基因的重组植物乳杆菌,以感染ALV-A的DF-1细胞的基因组DNA为模板,使用PCR方法扩增ALV-A Gp85蛋白的编码基因gp85,将树突状细胞靶向肽(DC-targeting peptide,DCpep)编码基因与gp85基因进行融合,获得gp85-DCpep基因;使用乳酸菌锚定表达载体pSIP409-pgsA’通过同源重组的方法构建重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85;经测序正确后将上述质粒分别电转化植物乳杆菌NC8感受态细胞,获得重组植物乳杆菌;使用SppIP诱导重组植物乳杆菌的表达,收集处于对数生长期的菌体,通过反复冻融获取细胞膜的蛋白样,采用Western blotting技术检测pgsA’-gp85-DCpep和pgsA’-gp85蛋白的表达情况。结果显示,试验成功获得基因片段gp85和gp85-DCpep,构建的重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85测序无突变和丢失情况,并成功电转到植物乳杆菌NC8感受态细胞中,使用SDS-PAGE和Western blotting技术在细胞膜蛋白样中检测到蛋白的表达,大小分别为48.3(pgsA’-gp85-DCpep)和47 ku(pgsA’-gp85)。本试验成功构建了重组质粒pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和pSIP409-pgsA’-gp85,获得的重组植物乳杆菌NC8-pSIP409-pgsA’-gp85-DCpep和NC8-pSIP409-pgsA’-gp85中的蛋白均成功表达,且具有反应原性,为后期深入研究重组植物乳杆菌在抗ALV-A感染中的保护机制奠定良好的基础。 展开更多
关键词 A亚群禽白血病病毒(ALV-A) gp85蛋白 植物乳杆菌 树突状细胞 锚定表达
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J亚群禽白血病病毒gp85蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
6
作者 刘丽娜 邵华斌 +4 位作者 栗绍文 杨峻 程国富 胡薛英 罗青平 《中国家禽》 北大核心 2014年第23期21-24,共4页
制备J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85蛋白单克隆抗体,采用本实验室表达的ALV-J gp85蛋白作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用获得的杂交瘤细胞制备腹水,用辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化... 制备J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85蛋白单克隆抗体,采用本实验室表达的ALV-J gp85蛋白作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,利用获得的杂交瘤细胞制备腹水,用辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化。结果获得了5株杂交瘤细胞:1B9、1G4、3A1、3D12、5G5。杂交瘤细胞上清抗体效价均在27以上,腹水抗体效价均在29以上。Western blot和间接免疫荧光试验表明,单克隆抗体可以与ALV-J gp85蛋白发生特异性反应。本研究制备的单克隆抗体为ALV-J抗原诊断试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病 gp85蛋白 单克隆抗体
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ALV-Jgp85重组蛋白与免疫佐剂联合接种雏鸡诱导免疫保护的研究 被引量：5
7
作者 窦文文 李宏梅 +5 位作者 成子强 刘建柱 刘海港 井维芳 崔治中 郭慧君 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期232-236,共5页
为研究原核表达J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85囊膜蛋白诱导雏鸡产生保护性抗体及抗ALV-J感染的作用,本研究采用ALV-J gp85重组蛋白与不同免疫佐剂接种雏鸡,检测其免疫后血清抗体变化,并在二免后第35 d进行攻毒,检测鸡体内病毒血症。结... 为研究原核表达J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85囊膜蛋白诱导雏鸡产生保护性抗体及抗ALV-J感染的作用,本研究采用ALV-J gp85重组蛋白与不同免疫佐剂接种雏鸡,检测其免疫后血清抗体变化,并在二免后第35 d进行攻毒,检测鸡体内病毒血症。结果显示单一gp85重组蛋白只能诱导少部分雏鸡产生抗体,抗体效价较低、维持时间短;而弗氏佐剂(F)和CpG(C)佐剂联合重组蛋白能够使所有的免疫鸡产生抗体,效价较高,维持时间约56 d;二次免疫可以增强免疫效果,高效价抗体维持时间进一步延长。重组蛋白免疫组减少病毒血症的免疫保护率为33.3%,而F佐剂组及F和C佐剂与重组蛋白联合免疫组免疫保护率分别为53.8%和66.7%;另外,F和C佐剂与重组蛋白联合免疫明显增强机体对病毒的抵抗力。以上结果表明使用F和C佐剂可以增强gp85重组蛋白的免疫原性,产生较好免疫保护作用,为开发有效的ALV-J亚单位疫苗提供实验依据。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒 囊膜蛋白gp85基因 免疫佐剂 免疫保护
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J亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析 被引量：2
8
作者 莫虹斐 余多 +2 位作者 孙淼 陈福勇 曹红 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2011年第12期3-7,共5页
J亚型禽白血病是由J亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性。本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段... J亚型禽白血病是由J亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性。本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J S1gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析。结果表明:ALV-J S1gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间。这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础。 展开更多
关键词 J亚群禽白血病病毒 gp85蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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