黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化 被引量：12

1

作者 张晓立 郑小梅 +5 位作者 满云 罗虎 于建东 郑平 刘浩 孙际宾 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期171-177,共7页

黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功,但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难,成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的... 黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功,但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难,成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的黑曲霉菌株为研究对象,对其原生质体的制备与再生以及PEG介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明,柠檬酸高产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养48 h的年轻菌丝体,在1.5%裂解酶-0.5%蜗牛酶-0.2%溶菌酶的复合酶解体系下裂解2.5 h,原生质体的制备浓度可达106个/m L以上,原生质体再生效率可达90%以上。原生质体的浓度是原生质体-PEG介导转化方法的关键,当原生质体浓度达到106个/m L以上时,高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体-PEG所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。 展开更多

关键词 黑曲霉 柠檬酸 遗传操作系统 原生质体 DNA转化

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台勾霉素生产菌指孢囊菌NRRL 18085遗传操作体系的建立 被引量：6

2

作者 肖毅 李苏梅 +3 位作者 马亮 张改云 鞠建华 张长生 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1014-1022,共9页

【目的】建立新型大环内酯类抗生素台勾霉素的生产菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum NRRL18085的遗传操作体系,实现台勾霉素相关生物合成基因的敲除突变。【方法】以整合型质粒pSET152为载体,建立了外源DNA通过接合转移进入指... 【目的】建立新型大环内酯类抗生素台勾霉素的生产菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum NRRL18085的遗传操作体系,实现台勾霉素相关生物合成基因的敲除突变。【方法】以整合型质粒pSET152为载体,建立了外源DNA通过接合转移进入指孢囊菌NRRL18085的操作方法和培养条件,利用PCR-targeting系统在体外构建了一个台勾霉素卤化酶基因敲除的cosmid质粒,通过接合转移转入到指孢囊菌NRRL18085野生菌中。【结果】获得了台勾霉素卤化酶基因敲除的指孢囊菌NRRL18085的双交换突变株,该突变株失去了产生台勾霉素的能力。【结论】成功建立和优化了指孢囊菌NRRL18085菌株的遗传操作体系,使得在体内分析和鉴定台勾霉素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考。 展开更多

关键词 指孢囊菌 遗传体系 台勾霉素 生物合成 卤化酶

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非模式真菌雷斯青霉遗传操作系统的建立

3

作者 张姝 陈登辉 +2 位作者 陈国参 徐新然 尹文兵 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期86-95,共10页

雷斯青霉Penicillium raistrickii能够产生丰富的次级代谢产物,然而,对其生物合成途径和沉默基因簇的产物研究鲜有报道,这是由于高效遗传操作系统的缺乏严重阻碍了其分子生物学机制研究和天然产物的开发利用。本研究建立了未作为特定对... 雷斯青霉Penicillium raistrickii能够产生丰富的次级代谢产物,然而,对其生物合成途径和沉默基因簇的产物研究鲜有报道,这是由于高效遗传操作系统的缺乏严重阻碍了其分子生物学机制研究和天然产物的开发利用。本研究建立了未作为特定对象广泛研究的非模式真菌雷斯青霉CGMCC 3.1066的遗传操作系统。我们逐步确定了孢子萌发培养条件、抗生素筛选浓度、原生质体制备条件和转化DNA片段浓度,利用PEG介导的原生质体转化技术,成功敲除了5个长度分布在1-10kb的基因,平均敲除阳性率为17.5%。此外,我们敲除了雷斯青霉中黑色素前体1,8-dihydroxynaphthalene(DHN)-melanin的合成基因。结果表明,该基因的缺失会导致雷斯青霉孢子颜色变为白色,但不影响正常生长,这使得该位点可作为以雷斯青霉为宿主的异源表达整合位点,可快速可视化辨别整合外源基因的转化子。雷斯青霉遗传操作系统的建立,将为其基因功能鉴定、化合物生物合成途径解析等研究奠定基础,同时为其他非模式丝状真菌转化体系的建立提供重要参考。 展开更多

关键词 雷斯青霉 遗传操作系统 基因敲除 潮霉素B 原生质体

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浅蓝霉素产生菌海洋异壁放线菌WH1-2216-6遗传操作体系的建立 被引量：3

4

作者 林钦恒 张光涛 +4 位作者 李苏梅 张海波 鞠建华 朱伟明 张长生 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1032-1041,共10页

【目的】建立二联吡啶类抗生素浅蓝霉素的产生菌海洋异壁放线菌Actinoalloteichus sp.WH1-2216-6的遗传操作体系,以便对浅蓝霉素的相关生物合成基因进行体内敲除和基因回补等遗传操作。【方法】以整合型质粒pSET152为外源DNA,探索和优... 【目的】建立二联吡啶类抗生素浅蓝霉素的产生菌海洋异壁放线菌Actinoalloteichus sp.WH1-2216-6的遗传操作体系,以便对浅蓝霉素的相关生物合成基因进行体内敲除和基因回补等遗传操作。【方法】以整合型质粒pSET152为外源DNA,探索和优化了异壁放线菌WH1-2216-6菌株与大肠杆菌进行接合转移实验的方法和条件,以此为基础,利用PCR-targeting系统在体外构建了一个浅蓝霉素二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶基因敲除的cosmid质粒pCSG2104,并在优化后的条件下通过接合转移将其转入异壁放线菌WH1-2216-6野生型菌株。【结果】获得了异壁放线菌WH1-2216-6菌株的浅蓝霉素二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶基因缺失的双交换突变株,发酵结果显示该突变株失去了产生浅蓝霉素A和浅蓝霉素D的能力。【结论】高浓度的MgSO4对大肠杆菌与异壁放线菌的接合转移有促进作用,介导了异壁放线菌WH1-2216-6菌株的遗传操作体系的成功建立,为进一步研究浅蓝霉素的生物合成基因和对浅蓝霉素结构进行组合生物合成改造奠定了基础,同时也为其他类似放线菌的遗传操作体系的建立提供了借鉴和参考。 展开更多

关键词 异壁放线菌 遗传体系 浅蓝霉素 生物合成 二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶

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曲张链菌素产生菌壮观链霉菌NRRL2494菌株遗传操作体系的建立 被引量：2

5

作者 宋姣姣 康前进 +2 位作者 张连茹 吴莹莹 白林泉 《厦门大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期60-66,共7页

曲张链菌素属于安莎类抗生素,具有显著的生物活性.在从壮观链霉菌NRRL2494菌株的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上,探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培养条件.以游离型质粒pJTU1... 曲张链菌素属于安莎类抗生素,具有显著的生物活性.在从壮观链霉菌NRRL2494菌株的发酵产物中分离和鉴定了多组分曲张链菌素的基础上,探索和优化了外源DNA通过接合转移进入壮观链霉菌NRRL2494菌株的操作方法和培养条件.以游离型质粒pJTU1278为载体,在体外构建了一个曲张链菌素酰胺合酶基因svaF敲除的质粒,通过接合转移转入到壮观链霉菌NRRL2494野生型菌株中,所获得的svaF基因缺失突变株失去了产生曲张链菌素的能力.该遗传操作体系的成功建立和优化,使得在体内分析和鉴定曲张链菌素生物合成基因的功能成为可能,同时也为建立其他类似放线菌的遗传操作体系提供了参考. 展开更多

关键词 壮观链霉菌 遗传操作体系 曲张链菌素 生物合成 酰胺合酶

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巨大芽胞杆菌——一个大型微生物细胞工厂 被引量：1

6

作者 周潮洋 易忠权 +2 位作者 裴涛 陈雪婷 闫新 《氨基酸和生物资源》 CAS 2014年第3期7-11,共5页

巨大芽胞杆菌广泛存在于自然环境中,是体型巨大的细菌之一,其机理和应用研究已有100多年历史。目前,巨大芽胞杆菌在生物学研究、化合物与酶制剂生产等方面都发挥着越来越重要的作用,同时,关于巨大芽胞杆菌的基因组学、生理学和遗传操作... 巨大芽胞杆菌广泛存在于自然环境中,是体型巨大的细菌之一,其机理和应用研究已有100多年历史。目前,巨大芽胞杆菌在生物学研究、化合物与酶制剂生产等方面都发挥着越来越重要的作用,同时,关于巨大芽胞杆菌的基因组学、生理学和遗传操作体系的研究也进展迅速。本文介绍了巨大芽胞杆菌的研究史、重要研究机构和研究方向,重点综述了巨大芽胞杆菌的遗传操作体系和蛋白表达系统,并进一步分析了该表达系统的问题及发展方向。 展开更多

关键词 巨大芽胞杆菌 遗传操作体系 蛋白表达系统

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超嗜热古菌遗传操作系统研究进展 被引量：1

7

作者 王飞雁 张松涛 +2 位作者 黄奇洪 申玉龙 倪金凤 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1418-1423,共6页

遗传操作系统,是研究基因和基因产物功能的一个极为重要的工具。超嗜热古菌遗传操作系统方面的研究落后于甲烷菌及嗜盐古菌中的研究,主要原因是选择标记的缺乏。然而,近十年来,在以硫化叶菌(Sulfolobus)为代表的超嗜热泉古菌和Thermococ... 遗传操作系统,是研究基因和基因产物功能的一个极为重要的工具。超嗜热古菌遗传操作系统方面的研究落后于甲烷菌及嗜盐古菌中的研究,主要原因是选择标记的缺乏。然而,近十年来,在以硫化叶菌(Sulfolobus)为代表的超嗜热泉古菌和Thermococcus kodakaraensis为代表的超嗜热广古菌中,遗传操作系统研究取得了很大的进展。本文主要对这两种超嗜热古菌的遗传操作系统进展以及应用进行概述。 展开更多

关键词 超嗜热古菌 遗传操作系统 SULFOLOBUS THERMOCOCCUS kodakaraensis

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冰岛硫化叶菌遗传操作体系的研究进展 被引量：1

8

作者 刘涛 王晓婕 +1 位作者 李英俊 彭楠 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期398-406,共9页

冰岛硫化叶菌是古菌研究中常用的模式菌株,为人们研究古菌复制、细胞周期以及CRISPR-Cas系统等作出了巨大贡献。冰岛硫化叶菌遗传操作体系的建立与完善对古菌学的全面深入研究起至关重要的作用。本文介绍了冰岛硫化叶菌遗传操作体系所... 冰岛硫化叶菌是古菌研究中常用的模式菌株,为人们研究古菌复制、细胞周期以及CRISPR-Cas系统等作出了巨大贡献。冰岛硫化叶菌遗传操作体系的建立与完善对古菌学的全面深入研究起至关重要的作用。本文介绍了冰岛硫化叶菌遗传操作体系所使用的质粒载体、筛选标记和转化方法,论述了目前广泛使用的两类冰岛硫化叶菌基因敲除体系。最后提出了现有冰岛硫化叶菌基因操作体系存在的主要问题,并对其发展方向进行了展望。 展开更多

关键词 冰岛硫化叶菌 遗传操作 基因敲除 CRISPR-Cas系统

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新城疫载体系统表达天蚕素AD抗菌肽及其抑菌效果 被引量：1

9

作者 任项霏 冯贺龙 +11 位作者 徐英英 李丽 杨宏春 王鑫 商雨 阳柳君 周祖涛 李自力 刘梅 罗青平 胡思顺 温国元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1820-1827,共8页

为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚... 为探究天蚕素AD抗菌肽是否能在新城疫病毒(NDV)载体系统中表达,且通过该种表达系统得到的CAD是否有生物活性。采用同源重组的方式将CAD插入至NDV载体pTS09-C中,并利用反向遗传操作系统成功拯救出重组病毒rTS-CAD,该重组病毒能在SPF鸡胚中稳定增殖。通过生物学特性分析,在NDV TS09-C株的P和M基因之间插入CAD基因并未改变其的弱毒和增殖特性。间接免疫荧光试验证实重组病毒能在BHK-21细胞中稳定表达CAD抗菌肽。抑菌试验结果显示,NDV载体系统表达的CAD对金黄色葡萄球菌(G+)和大肠杆菌(G-)均有一定的抑制作用:在微孔板法抑菌试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率为79.6%~91.7%,对大肠杆菌的抑制率为87.5%~89.8%;在与DF-1细胞共培养试验中,重组病毒表达的CAD抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑制率可以达到74.5%~77.7%,对大肠杆菌的抑制率为35.0%~45.0%。本研究表明,NDV载体系统能够成功表达出有活性的CAD抗菌肽,且有良好的抑菌效果。这一研究为探索NDV载体表达抗菌肽和进一步研究CAD的局部效应奠定了一定的理论基础。 展开更多

关键词 天蚕素AD 新城疫病毒载体 反向遗传操作系统 抗菌肽

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利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒 被引量：2

10

作者 郝景波 吴云舟 +3 位作者 刘艾林 尹杰超 任桂萍 李德山 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期73-77,共5页

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝... 将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。 展开更多

关键词 新城疫病毒 病毒拯救 共转染 反向遗传操作系统

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热球菌目(Thermococcales)遗传操作系统研究与应用进展

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作者 付寅坤 肖湘 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期28-34,共7页

热球菌目(Thermococcales)是一类分离自浅海热泉或者深海热液口的超嗜热微生物,包括火球菌(Pyrococcus)、热球菌(Thermococcus)、古老球菌(Palaeococcus)。研究其生命活动的分子机制,基因的功能等必须借助遗传操作系统。由于选择标记的... 热球菌目(Thermococcales)是一类分离自浅海热泉或者深海热液口的超嗜热微生物,包括火球菌(Pyrococcus)、热球菌(Thermococcus)、古老球菌(Palaeococcus)。研究其生命活动的分子机制,基因的功能等必须借助遗传操作系统。由于选择标记的限制,Thermococcales遗传操作系统落后于其他菌株。近年来,在Thermococcales发现了内源质粒并可以将其改造用作遗传工具。如在Thermococcus kodakarensis及Pyrococcus furious等菌株内都建立了成熟的遗传系统,并用于基因敲除以及基因表达。将就Thermococcales内源质粒的发现和遗传操作系统的发展与应用加以阐述。 展开更多

关键词 Thermococcales 遗传操作系统 营养缺陷标记 抗生素标记 穿梭载体

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