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基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑 被引量：11
1
作者 季新 李飞 +6 位作者 晏云 孙红正 张静 李俊周 彭廷 杜彦修 赵全志 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第15期2861-2871,共11页
【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰... 【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表� 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑 OsPIL15 脱靶效应
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CRISPR/Cas9介导的植物基因编辑技术研究进展 被引量：11
2
作者 时欢 林玉玲 +2 位作者 赖钟雄 杜宜殷 黄鹏林 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期640-650,共11页
植物在生长与发育过程中,常遭遇物理、化学或生物性逆境,运用基因编辑技术（Genome editing）有机会了解并克服这些威胁.串联间隔短回文重复序列CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associ... 植物在生长与发育过程中,常遭遇物理、化学或生物性逆境,运用基因编辑技术（Genome editing）有机会了解并克服这些威胁.串联间隔短回文重复序列CRISPR/Cas（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein）是近几年来新发现的一种基因定点编辑技术,不仅在基因组解析上是阐明基因功能的重要工具,在植物育种上更为划时代的重大突破.CRISPR系统与细菌抵御外源遗传物质入侵的免疫系统有关,目前,应用最多的是Ⅱ型的CRISPR/Cas9,只需核酸酶Cas9和成熟的crRNA：tracrRNA（CRISPR-derived RNA：trans-activating RNA）复合体就可对特定外源DNA序列进行剪切,该技术已经在拟南芥、烟草、大豆、番茄、马铃薯、水稻、小麦、玉米、高粱、矮牵牛、香蕉、甜橙、苹果、毛白杨及地钱等植物中实现了成功编辑,证明了此基因编辑技术的可行性,并达到植物抗逆境、延缓果实成熟、增加杀草剂耐受性、抗病等效果.Cas9和gRNA的启动子与gRNA的靶标数目对基因编辑效率有所影响,值得进一步深入研究. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 sgRNA 植物 基因编辑 碱基突变 编辑效率
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CRISPR基因编辑技术加速蔬菜作物遗传改良
3
作者 任文静 司劲超 +6 位作者 陈立 杨丽梅 庄木 吕红豪 王勇 季家磊 张扬勇 《中国农学通报》 2024年第24期107-115,共9页
现代生物技术,特别是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,对作物遗传改良产生了深远影响。本文综合分析了CRISPR/Cas基因编辑系统的组成、机制,综述了基因编辑技术在蔬菜作物基因功能验证和作物遗传改良方面取得的突破性进展,及其在蔬菜... 现代生物技术,特别是基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术,对作物遗传改良产生了深远影响。本文综合分析了CRISPR/Cas基因编辑系统的组成、机制,综述了基因编辑技术在蔬菜作物基因功能验证和作物遗传改良方面取得的突破性进展,及其在蔬菜作物如番茄、西瓜、甘蓝、胡萝卜和黄瓜等中的应用。CRISPR/Cas基因编辑系统是目前应用最广泛的基因编辑系统,为了加深对CRISPR/Cas基因编辑系统的了解、促进其在蔬菜作物改良中的重要作用,本研究探讨了影响遗传转化效率的因素,提出了提高转化效率的策略,讨论了当前技术的局限性,如作物转化再生难度和基因型的依赖性。本文强调,筛选易于遗传转化的品种、开发高效的植物转化和再生系统,以及创造更高效、精确和多功能的基因编辑工具是未来研究的关键方向。 展开更多
关键词 现代育种技术 CRISPR/Cas系统 CRISPR基因编辑 基因编辑效率 基因功能验证 作物遗传改良 蔬菜作物改良 遗传转化效率 生物技术
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基于CRISPR/Cas系统的基因编辑工具及其改进策略 被引量：2
4
作者 辛圆 田开仁 +1 位作者 乔建军 财音青格乐 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期72-85,共14页
CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于DSBs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了... CRISPR/Cas系统自发现以来持续推动着生命科学领域的进步。与此同时,CRISPR/Cas介导的基因编辑技术也在不断发展壮大。基于DSBs修复的CRISPR/Cas基因编辑技术、碱基编辑器和先导编辑器等新型基因编辑工具的开发为生物学基础研究铺平了道路。虽然这些工具为生物技术带来了革命性变化,但基因编辑效率偏低、产物纯度不高、脱靶效应频繁等问题也随之而来。不断开发精确、高效和安全的CRISPR/Cas基因编辑工具仍是当前和未来的生命科学研究热点。概述了CRISPR/Cas基因编辑工具的发展、构成及原理,总结了CRISPR/Cas基因编辑系统提升编辑效率、扩展编辑范围和降低脱靶效应的通用策略及不同CRISPR/Cas基因编辑工具的改进方法,并就CRISPR/Cas基因编辑工具未来的研究方向进行展望。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 基因编辑效率 DSBs 碱基编辑器 先导编辑器
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基于CRISPR/Cas9技术的HCT-8细胞基因编辑系统构建
5
作者 李娜 王悦欣 +5 位作者 李孝法 王璐阳 梁冠达 李俊强 张龙现 李晓迎 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2023年第4期632-638,共7页
【目的】构建人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现对目的基因的高效编辑。【方法】采用慢病毒感染的方式,将慢病毒载体质粒LentiCas9-Blast与包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染至人胚胎... 【目的】构建人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现对目的基因的高效编辑。【方法】采用慢病毒感染的方式,将慢病毒载体质粒LentiCas9-Blast与包装质粒pSPAX2和pMD2.G共转染至人胚胎肾(human embryonic kidney 293T,HEK293T)细胞系获得高滴度的重组慢病毒液,并感染HCT-8细胞系,以未感染组为阴性对照,用杀稻瘟菌素进行抗性筛选,直至阴性对照组全部死亡;采用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆筛选,对筛选得到的单克隆细胞系进行扩大培养,并采用PCR及Western Blot试验验证Cas9基因及其蛋白表达情况,而后对阳性单克隆细胞系进行基因编辑效率及细胞系活性验证。【结果】得到能成功表达Cas9蛋白的6株HCT-8-Cas9单克隆细胞系。其中HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4细胞系蛋白量表达较高;对所筛选单克隆细胞系进行基因编辑效率检测,pXPR_011慢病毒表达报告基因载体系统检测结果表明,HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系Cas9基因编辑效率为48.82%,显著高于其他HCT-8-Cas9单克隆细胞系;单克隆细胞系活性检测结果表明,HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系细胞活性与HCT-8细胞系相比均无显著差异。【结论】HCT-8-Cas9_4细胞系能够稳定表达Cas9蛋白,具有良好的编辑效率,可用于后续靶标基因的高效编辑。 展开更多
关键词 基因编辑 慢病毒 人回盲肠癌(HCT-8)细胞 CRISPR/Cas9 基因编辑效率
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构建大肠埃希菌底盘细胞合成N-糖基化蛋白的研究进展
6
作者 包紫鑫 李威 +1 位作者 胡学军 丁宁 《生命的化学》 CAS 2023年第3期367-374,共8页
N-糖基化是自然界中主要的翻译后修饰之一,对蛋白质结构和功能的影响十分重要。随着糖工程领域的快速发展,在大肠埃希菌(Escherichia coli)中完成治疗性蛋白的N-糖基化修饰变得更加普遍。利用基因编辑技术对大肠埃希菌基因组进行编辑,... N-糖基化是自然界中主要的翻译后修饰之一,对蛋白质结构和功能的影响十分重要。随着糖工程领域的快速发展,在大肠埃希菌(Escherichia coli)中完成治疗性蛋白的N-糖基化修饰变得更加普遍。利用基因编辑技术对大肠埃希菌基因组进行编辑,使大肠埃希菌获得新的性状和生产能力,可以提高目标糖蛋白的产量。本文综述了通过基因编辑技术改造大肠埃希菌基因组来构建大肠埃希菌底盘细胞,及在此基础上优化N-糖基化效率以提高N-糖基化蛋白产量的研究进展,为构建具有N-糖基化修饰功能的工程菌株提供依据,为更好地进行糖蛋白生产,及进一步高效开发“糖蛋白工厂”提供策略。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 基因编辑 基因组 N-糖基化修饰 糖基化效率
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进展 被引量：2
7
作者 郭华荣 陶奕文 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期105-112,119,共9页
CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已... CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种由gRNA(guide RNA)引导的Cas9核酸内切酶靶向编辑技术,已广泛用于基因的敲除、敲入和敲降,其操作简便快速,成本低,已成为人们探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因以及改良经济物种种质性状的重要工具。目前,该技术已经在少数几种水生甲壳动物中得到成功应用,但是由于显微注射技术在应用上的局限性,该技术在许多重要海水养殖经济物种如对虾中的应用受到限制,导致其基因编辑效率低下,难以广泛开展。本文对CRISPR/Cas9基因编辑技术在水生甲壳动物中的应用进行了综述和展望,为今后海水养殖虾蟹类的基因功能研究以及遗传育种研究提供参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9基因编辑技术 水生甲壳动物 应用 显微注射 基因编辑效率
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电转条件对Cas9核糖核蛋白基因编辑效率的影响 被引量：1
8
作者 夏凯 韩玲 +3 位作者 孔华庭 闫庆龙 张瑜 诸颖 《核技术》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期77-81,共5页
直接向细胞内输运CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)对于进行各种基因编辑、基因表达调控和DNA/RNA成像具有重要意义。电转是向细胞内导入Cas9 RNP的重要方法。本工作研究了电压、脉冲长度及脉冲次数等电转条件对Cas9 RNP细胞内基... 直接向细胞内输运CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(Cas9 RNP)对于进行各种基因编辑、基因表达调控和DNA/RNA成像具有重要意义。电转是向细胞内导入Cas9 RNP的重要方法。本工作研究了电压、脉冲长度及脉冲次数等电转条件对Cas9 RNP细胞内基因编辑效率的影响,评估了不同电转条件下的细胞存活率。结果显示:电压为1 300 V,脉冲次数为1,脉冲宽度为30 ms时,Cas9 RNP具有较高的基因编辑效率且生物安全性较好。本工作为CRISPR/Cas9复合物进一步的生物医学应用提供了指导依据。 展开更多
关键词 Cas9核糖核蛋白(Cas9 RNP) 电转条件 直接输运 编辑效率 生物相容性
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甘蓝型油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因BnHemd的克隆和功能分析
9
作者 郑潇潇 朱瑶瑶 +3 位作者 梁华兵 詹杰鹏 师家勤 王新发 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期380-389,共10页
为探讨油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因Bn Hemd的功能及其与叶绿素合成的关系,促进光合效率和产量的提升,利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中双11号中该基因在A9和C8染色体上的两个拷贝进行编辑。从中双11号中克隆到基因Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd... 为探讨油菜尿卟啉原Ⅲ合成酶基因Bn Hemd的功能及其与叶绿素合成的关系,促进光合效率和产量的提升,利用基因编辑技术对甘蓝型油菜中双11号中该基因在A9和C8染色体上的两个拷贝进行编辑。从中双11号中克隆到基因Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd,CDS序列分别为885 bp和876 bp,均由9个外显子构成,各编码294和291个氨基酸残基。Bn Hemd蛋白性质与结构分析结果表明,甘蓝型油菜中基因Bn Hemd的两个拷贝的蛋白理化性质十分相似,均为不稳定蛋白,相对分子质量分别为31.97 k D和31.40 k D。系统进化树分析表明,Bn A09.Hemd和Bn C08.Hemd分别与白菜和甘蓝中的同源基因亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,Bn Hemd在中双11号的根、茎、叶、花蕾、种子和角果皮中均有表达,在角果皮和花蕾中的表达量远高于根、茎、叶。初步的功能分析结果表明,中双11号中该基因两个拷贝同时编辑的植株表现为:叶绿素含量显著减少、光合速率降低、生长迟缓,表明甘蓝型油菜BnHemd对叶绿素合成起重要作用,同时影响光合效率和生长发育。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 尿卟啉原Ⅲ合成酶 基因编辑 叶绿素 光合效率
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脂质体介导基因编辑载体质粒转染条件的优化
10
作者 白圣凯 野庆松 +4 位作者 张芳婷 盖厦梦 李文娜 张青峰 高书颖 《生物技术》 CAS 2019年第3期251-256,共6页
[目的]探讨脂质体介导基因编辑载体质粒转染人食管癌Eca-109细胞的最佳条件。[方法]以基于Cre/Lox P系统的p GT-A1B1和基于CRISPR/Cas9系统的p X458-sgRNA8两种基因编辑载体质粒为实验材料,将环状和线性质粒以不同DNA用量(0. 2、0. 4、0... [目的]探讨脂质体介导基因编辑载体质粒转染人食管癌Eca-109细胞的最佳条件。[方法]以基于Cre/Lox P系统的p GT-A1B1和基于CRISPR/Cas9系统的p X458-sgRNA8两种基因编辑载体质粒为实验材料,将环状和线性质粒以不同DNA用量(0. 2、0. 4、0. 6和0. 8μg)和不同DNA与脂质体比例(1∶1、1∶1. 5、1∶2、1∶2. 5和1∶3)转染Eca-109细胞,计算转染效率。[结果]不同DNA用量条件下,p GT-A1B1在0. 4μg和0. 6μg时转染效率较高,p X458-sgRNA8在0. 6μg时转染效率较高,与其它DNA用量比较均有显著性差异(P <0. 05)。不同DNA与脂质体比例条件下,p GT-A1B1在比例为1∶1. 5和1∶2时转染效率较高,p X458-sgRNA8在比例为1∶2. 5时转染效率较高,与其它比例比较均有显著性差异(P <0. 05)。同一种质粒的环状和线性结构形态,在DNA用量或DNA与脂质体比例相同时,转染效率差异不显著(P> 0. 05)。[结论]建立了脂质体介导基因编辑载体质粒转染Eca-109细胞的最佳转染条件,质粒p GT-A1B1和p X458-sgRNA8的DNA用量分别为0. 4~0. 6μg和0. 6μg,DNA与脂质体比例分别为1∶1. 5~1∶2和1∶2. 5。 展开更多
关键词 基因编辑载体 脂质体 转染效率 食管癌细胞
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