布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建 被引量：17

1

作者 潘文 王佳莹 +5 位作者 赵明秋 琚春梅 易琳 常艳 虞红娇 陈金顶 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期280-286,共7页

选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-... 选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-Δbp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转化入布鲁氏菌后,经过5μg/mL氯霉素筛选单交换子和70g/L蔗糖筛选同源重组双交换子,用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证。结果表明,bp26基因的缺失改造成功,连续传20代后菌落PCR及DNA测序的结果显示突变株具有遗传稳定性。以pRE112自杀质粒为基础构建无抗性基因标记的布鲁氏菌缺失株为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础,同时Δbp26缺失株的构建可为新型布鲁氏菌疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bp26基因 自杀质粒 基因缺失株

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溶藻弧菌T3SS exsD基因敲除突变株构建及其表型特征 被引量：6

2

作者 王俊霖 招茵 +6 位作者 苏茵茵 周诗慧 曾福源 谢妙 王娜 简纪常 庞欢瑛 《广东海洋大学学报》 CAS 北大核心 2021年第5期35-43,共9页

【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性... 【目的】构建溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)中的调控蛋白操纵子ExsD基因缺失株,研究exsD缺失株表型特征。【方法】采用overlapPCR技术构建缺失株ΔexsD,PCR检测缺失株ΔexsD的遗传稳定性,比较缺失株与野生株之间的生长速度、泳动能力、胞外酶活性、药物敏感性、毒力,分别采用结晶紫和共聚焦电镜方法测定生物膜的差异变化,通过qRT-PCR方法分析exsD的缺失对T3SS效应蛋白Hop转录的影响。【结果】缺失株ΔexsD构建成功;与野生株相比,ΔexsD遗传稳定性和生长速度无显著差别,但泳动能力极显著上升(P <0.01),胞外蛋白酶活性显著上升(P <0.05),形成生物膜能力在24 h时提高(P <0.05);相比野生株,ΔexsD对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、多西环素、新霉素的敏感性从耐药变成中度敏感;ΔexsD缺失株的毒力显著上升,野生株对斑马鱼的半数致死剂量是缺失株的3.68倍。实时荧光定量结果显示,与HY9901野生型相比,exsD基因的缺失增加了效应蛋白Hop的转录表达。【结论】exsD基因对T3SS的致病性起负调控作用,为进一步阐明exsD基因在溶藻弧菌中的作用机理提供一定的理论基础。 展开更多

关键词 溶藻弧菌 Ⅲ型分泌系统 exsD基因 基因敲除 缺失株 表型特征

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cya/crp基因缺失对鸡白痢沙门菌生物学特性影响的研究 被引量：2

3

作者 茹鹏辉 王文婕 +2 位作者 钱满 廖成水 张春杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期9-16,共8页

为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基... 为了解crp/cya基因对鸡白痢沙门菌毒力和生物学特性的影响,本研究构建缺失1182 bp cya基因的重组自杀性质粒pREΔcya,并经酶切和测序鉴定正确后,转化大肠杆菌χ7213作为供体菌,分别以鸡白痢沙门菌C79-13株和本研究室前期构建的其crp基因缺失株C79-13Δcrp(简写为Δcrp)为受体菌,利用重组自杀性质粒介导的同源重组技术构建C79-13菌株的单基因缺失株Δcya以及双基因缺失株ΔcrpΔcya,并均经PCR和测序鉴定。将这3株菌连续传60代后每隔10代分别利用PCR鉴定cya基因缺失的遗传稳定性;利用玻片凝集试验鉴定各菌株的血清型,并鉴定各菌株的生化反应特性;绘制各菌株的生长曲线分析缺失株与亲本株的生长特性;通过微量结晶紫法检测各菌株的生物被膜(BF)形成能力。PCR和测序鉴定结果显示Δcya、ΔcrpΔcya均正确构建,且cya基因缺失均具有稳定的遗传性。血清型及生化鉴定结果显示,菌株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya均保留了C79-13的O9血清型,而失去了发酵蔗糖、鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖等糖类的能力。生长曲线及BF形成能力的检测结果显示,各缺失株的生长速度较亲本株相比均显著降低,尤其双基因缺失株ΔcrpΔcya的生长速度极显著下降(P<0.01),且基因缺失株BF的形成能力均极显著降低(P<0.01),其中双基因缺失株BF的形成能力更低。将3株缺失菌及亲本菌分别以不同的剂量(5×10^(8)cfu/只~7×10^(11)cfu/只)经腹腔注射感染雏鸡进行毒力试验,计算各菌株对雏鸡的半数致死量(LD_(50))。将各缺失株以10^(7) cfu/mL两次经灌服免疫雏鸡,100μL/只,二免后7 d各组雏鸡均以5.0×10^(8)cfu/mL经腹腔注射亲本菌株C79-13进行攻毒试验,500μL/只,在42 d的观察期内观察并记录各组鸡的发病及死亡情况,计算各基因缺失株对雏鸡的免疫保护率。结果显示,缺失株Δcya、Δcrp、ΔcrpΔcya对雏鸡的LD_(50)分别为2.84×10^(9) cfu/mL、1.41×10^(10)cfu 展开更多

关键词 鸡白痢沙门菌 crp/cya基因 缺失株 生物学特性

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基于P72、MGF和CD2v基因的非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1

4

作者 张红云 陈秋英 +4 位作者 严斯刚 杜泓明 陆志翔 郑敏 罗廷荣 《广西农学报》 2023年第1期32-39,共8页

非洲猪瘟在临床上出现多种毒株,主要分为野毒株和基因变异毒株。因其在临床上造成不同程度的危害,有必要建立一种方法进行正确诊断和健康监测。为实现野毒株和基因变异毒株的鉴别诊断,研究根据GenBank中的ASFV中国流行株(登录号:MK33318... 非洲猪瘟在临床上出现多种毒株,主要分为野毒株和基因变异毒株。因其在临床上造成不同程度的危害,有必要建立一种方法进行正确诊断和健康监测。为实现野毒株和基因变异毒株的鉴别诊断,研究根据GenBank中的ASFV中国流行株(登录号:MK333180.1)的P72、CD2v、MGF基因保守序列设计引物,建立一种可以同时检测上述三种基因的三重荧光定量PCR方法。三重荧光定量PCR方法对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒2型(PRV)和猪圆环病毒(PCV2)检测均无交叉反应,表现出较强的特异性。敏感性检测显示针对P72、CD2v和MGF重组质粒标准品的最低检测下限为103~102 copies/mL。在重复性试验中,大部分组间变异系数均小于2%或接近2%,具有较好的重复性。试验表明,三重荧光定量PCR方法可用来鉴别野毒株和基因变异毒株。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 野毒株 基因缺失毒株 三重荧光定量PCR 检测方法

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单核细胞增生李斯特菌非编码RNA rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究 被引量：5

5

作者 谢堃 乔军 +6 位作者 孟庆玲 彭叶龙 赵海龙 马玉 陈诚 才学鹏 陈创夫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期998-1003,共6页

拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃... 拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组菌进行分子鉴定,测定缺失株与母源野毒株37℃条件下生长曲线。结果显示:PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代,PCR鉴定结果显示,该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比,在37℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P>0.05)。非编码RNArli87基因在37℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。 展开更多

关键词 rli87基因 LM感受态细胞 缺失株 生长特性 同源重组

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肠炎沙门菌C50041Δpag N缺失株的构建及其生物学特性分析 被引量：1

6

作者 胡凌芸 丁睿清 +6 位作者 王菲 刘钧 康喜龙 徐双媛 焦新安 潘志明 孟闯 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1019-1025,共7页

为研究肠炎沙门菌pagN基因功能,构建pagN缺失株C50041ΔpagN,比较其在生长运动、生化反应、黏附侵袭、抵御抗菌肽杀伤等方面与野生株的差异,分析pagN基因对肠炎沙门菌生物学特性的影响,进一步揭示该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。... 为研究肠炎沙门菌pagN基因功能,构建pagN缺失株C50041ΔpagN,比较其在生长运动、生化反应、黏附侵袭、抵御抗菌肽杀伤等方面与野生株的差异,分析pagN基因对肠炎沙门菌生物学特性的影响,进一步揭示该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。通过框内缺失突变技术成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔpagN缺失株,以野生株C50041为对照,发现C50041ΔpagN缺失株的生化特性、生长曲线以及运动性与C50041野生株一致,但对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.0172)和侵袭率(P=0.0478)以及抵御小鼠肠道抗菌肽杀伤的能力相比野生株显著下降。本研究结果提示,pagN基因的缺失不影响肠炎沙门菌的生化特性和生长、运动能力,但会显著降低肠炎沙门菌对宿主细胞的黏附和侵袭以及对肠道抗菌肽的耐受性,初步显示其对沙门菌致病性的影响。本研究探究了肠炎沙门菌pagN基因缺失株的生物学特性,为后续深入研究奠定了基础。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 pagN基因 缺失株 黏附 侵袭 抗菌肽

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鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株与野生株多重qPCR方法的建立

7

作者 卓玛 钱炳旭 +2 位作者 薛峰 戴建君 吴晓东 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1089-1094,共6页

为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD2v、MGF110-9L基因的多重q... 为开发一种快速、灵敏的非洲猪瘟病毒(ASFV)野生型株与基因缺失型株的鉴别诊断方法,本研究通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-9L基因保守序列设计特异性引物和探针,并对体系进行优化,建立了一种可以同时检测p72、CD2v、MGF110-9L基因的多重q PCR方法。该方法与其他常见猪病毒性病原均无交叉反应,特异性强;敏感性试验结果显示,该方法对p72、CD2v和MGF110-9L重组质粒标准品的最低检出限均为102copies/mL,敏感性好;组内变异系数为0.03%~0.5%,组间变异系数为0.04%~1.5%,表明该方法重复性好。利用本方法和普通qPCR方法分别对50份临床样品进行检测,结果显示,两种检测方法对ASFV核酸的检出率均为70%(35/50),符合率为100%。综上所述,本研究建立的多重qPCR方法为临床鉴别检测ASFV野毒株与基因缺失株提供了重要材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 基因缺失型株 p72 MGF110-9L CD2v

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非洲猪瘟疫苗研究进展

8

作者 时云朵 孙豪 +1 位作者 曹恬雪 郑灿财 《饲料博览》 2023年第4期20-24,30,共6页

非洲猪瘟是非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、出血性和高度接触性的传染病,最急性和急性感染病死率近100%。猪是非洲猪瘟病毒的唯一自然宿主,该病对养猪业危害巨大,由于非洲猪瘟病毒基因组庞大和免疫逃逸机制复杂,目前尚未有针对该病... 非洲猪瘟是非洲猪瘟病毒引起的一种急性、热性、出血性和高度接触性的传染病,最急性和急性感染病死率近100%。猪是非洲猪瘟病毒的唯一自然宿主,该病对养猪业危害巨大,由于非洲猪瘟病毒基因组庞大和免疫逃逸机制复杂,目前尚未有针对该病的有效疫苗,经研究分析,研制基因缺失疫苗和弱毒疫苗前景较为乐观。文章概述了非洲猪瘟疫苗研制面临的挑战和进展,以期为非洲猪瘟疫苗开发及应用提供参考。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 基因缺失 弱毒株疫苗

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肠炎沙门菌lpfC基因缺失株的构建及基本生物学特性研究 被引量：4

9

作者 王晓春 焦扬 +5 位作者 程瞾 吴颖斐 康喜龙 胡亚辰 李求春 焦新安 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期256-261,274,共7页

[目的]为研究与Lpf菌毛合成相关的lpfC基因对肠炎沙门菌致病性的影响。[方法]利用自杀质粒介导的同源重组技术构建肠炎沙门菌C50041株的lpfC基因缺失株C50041ΔlpfC,并进行PCR和测序鉴定。同时,将lpfC基因克隆至质粒pBR322并电转入缺失... [目的]为研究与Lpf菌毛合成相关的lpfC基因对肠炎沙门菌致病性的影响。[方法]利用自杀质粒介导的同源重组技术构建肠炎沙门菌C50041株的lpfC基因缺失株C50041ΔlpfC,并进行PCR和测序鉴定。同时,将lpfC基因克隆至质粒pBR322并电转入缺失株中,构建回复株C50041ΔlpfCR。比较野生株C50041、缺失株C50041ΔlpfC及回复株C50041ΔlpfCR的基本生物学特性。[结果]成功构建了缺失株C50041ΔlpfC及回复株C50041ΔlpfCR,且lpfC基因的缺失不影响C50041的生长特性和生化特性。该缺失株具有良好的遗传稳定性,但缺失株对BALB/c小鼠的LD50是野生株的2倍。[结论]lpfC基因的缺失使肠炎沙门菌对BALB/c小鼠的毒力降低,为进一步研究肠炎沙门菌Lpf菌毛的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 lpfC基因 同源重组 缺失株

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鲍曼不动杆菌bauA与basD基因缺失株的构建及其生物学功能研究 被引量：2

10

作者 南楠 高洁 +2 位作者 宫赛赛 李涛 王慧 《军事医学》 CAS 2022年第3期179-183,187,共6页

目的构建鲍曼不动杆菌bauA与basD基因缺失株,研究铁载体相关基因对鲍曼不动杆菌生存及致病性的影响。方法构建pMO130-Tel^(R)-bauA(Up/Down)及pMO130-Tel^(R)-basD(Up/Down)质粒,通过同源重组获得基因缺失株;通过基因缺失株生长曲线测... 目的构建鲍曼不动杆菌bauA与basD基因缺失株,研究铁载体相关基因对鲍曼不动杆菌生存及致病性的影响。方法构建pMO130-Tel^(R)-bauA(Up/Down)及pMO130-Tel^(R)-basD(Up/Down)质粒,通过同源重组获得基因缺失株;通过基因缺失株生长曲线测定、运动能力比较、生物膜的形成及胞内存活能力测定等方法对缺失株的功能进行了测试。结果通过构建含同源片段的重组pMO130-Tel^(R)质粒,分别成功敲除鲍曼不动杆菌4294中的bauA基因和basD基因,突变株在缺铁条件下生长能力显著下降,运动能力、生物膜形成能力及胞内存活能力也有不同程度的下降。结论bauA基因和basD基因敲除对鲍曼不动杆菌生存有很大影响,提示铁载体相关基因在细菌致病中发挥重要作用。 展开更多

关键词 鲍曼不动杆菌 基因缺失株 铁载体

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肠炎沙门菌双组份系统qseC基因缺失株的构建及其生物学特性分析 被引量：3

11

作者 丁睿清 徐双媛 +5 位作者 马贞锦疆 王新为 康喜龙 孟闯 潘志明 焦新安 《中国家禽》 北大核心 2021年第11期20-27,共8页

为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框... 为研究肠炎沙门菌qseC基因功能,构建qseC缺失株C50041ΔqseC以及回复株C50041ΔqseC::qseC,分析qseC基因缺失对肠炎沙门菌生化特性、生长曲线、运动性、黏附侵袭等方面的影响,探究该基因在肠炎沙门菌感染致病中的作用。结果显示:利用框内缺失突变技术成功获得肠炎沙门菌C50041ΔqseC缺失株,以野生株C50041、回复株C50041ΔqseC::qseC为对照,发现C50041ΔqseC缺失株的生化特性、生长曲线与C50041野生株一致,但其运动性(P=0.0019)以及对巨噬细胞J774A.1的黏附率(P=0.0325)、侵袭率(P=0.0053)相比野生株显著下降。研究提示:qseC基因的缺失对肠炎沙门菌的生化特性和生长曲线没有影响,但会显著降低肠炎沙门菌的运动能力及对宿主细胞的黏附和侵袭。研究初步探究了肠炎沙门菌qseC基因的功能,为后续深入研究奠定基础。 展开更多

关键词 肠炎沙门菌 qseC基因 缺失株 黏附 侵袭

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单增李斯特菌lmo0331基因缺失株的构建及对环境耐受性的影响 被引量：3

12

作者 杜冬冬 康立超 +4 位作者 张奇文 李红欢 钱凌霄 李庆辉 马勋 《动物医学进展》 北大核心 2020年第5期12-18,共7页

为了研究Lmo0331蛋白在单增李斯特菌环境适应性中发挥的作用,利用同源重组的技术构建LM90SB2△lmo0331基因缺失株,比较在不同温度、pH、渗透压下的生长特性和生物被膜形成能力与野毒株的差异。结果显示,在4℃环境下及含5g/L NaCl的BHI... 为了研究Lmo0331蛋白在单增李斯特菌环境适应性中发挥的作用,利用同源重组的技术构建LM90SB2△lmo0331基因缺失株,比较在不同温度、pH、渗透压下的生长特性和生物被膜形成能力与野毒株的差异。结果显示,在4℃环境下及含5g/L NaCl的BHI培养基中,LM90SB△lmo0331缺失株的生长速度显著高于LM90SB2野毒株(P<0.05);在pH9的碱性环境及含45mL/L乙醇的BHI培养基中,LM90SB2△lmo0331缺失株繁殖数量低于野毒株(P<0.05);其他条件下,LM90SB△lmo0331缺失株与野毒株的生长无显著差异;LM90SB2和LM90SB2△lmo0331在不同时间点生物被膜形成密度无显著差异。由此表明,Lmo0331蛋白可能在低温和碱性条件下发挥不同作用,这一结果为研究LM在胁迫环境生存机制奠定了基础。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 lmo0331基因 缺失株 环境耐受

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肠炎沙门菌glpK基因缺失株的生物学特性及其免疫效果评价的研究 被引量：1

13

作者 冀梦瑶 周诗淼 +4 位作者 蒋卉 张莹辉 彭小薇 李佩国 吴同垒 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期471-476,共6页

为分析甘油激酶(GlpK)对肠炎沙门菌毒力的影响,本研究使用野生菌株c50336和glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK进行体外模拟应激试验,分析glpK基因缺失对沙门菌抵抗应激环境的影响。将这两株菌分别以MOI 100感染鼠源巨噬细胞Raw264.7,在不同... 为分析甘油激酶(GlpK)对肠炎沙门菌毒力的影响,本研究使用野生菌株c50336和glpK基因缺失菌株c50336ΔglpK进行体外模拟应激试验,分析glpK基因缺失对沙门菌抵抗应激环境的影响。将这两株菌分别以MOI 100感染鼠源巨噬细胞Raw264.7,在不同时间点计算胞内存活的细菌数,以评价glpK基因的缺失对沙门菌胞内存活率的影响;将菌株c50336和c50336ΔglpK腹腔注射小鼠,利用寇氏法计算各菌株对小鼠的半数致死量(LD;)。结果显示,与c50336相比,c50336ΔglpK在氧化和高渗环境中的存活率极显著降低(0.001<P<0.01),但在酸性和碱性环境中的存活率无明显变化,且在巨噬细胞内的存活率明显降低;LD_(50)测定结果显示,c50336ΔglpK和c50336对小鼠的LD_(50)分别为1.6×10^(7) cfu和6.7×10^(2) cfu。将菌株c50336ΔglpK以2.1×10^(6)cfu/只的剂量免疫BALB/c小鼠,14d后二免,首免28d时,以1.5×10^(5) cfu/只注射菌株c50336,计算15 d内小鼠的免疫保护率;按上述方法免疫小鼠一次,分别在免疫后3d、10d和21d,对各组小鼠采血分离血清,经间接ELISA检测小鼠血清抗体水平;取脾脏称重,计算脾脏指数;采用细菌计数法测定小鼠脾脏载菌量;制备免疫小鼠脾淋巴细胞悬液,分别经c50336ΔglpK全菌蛋白和ConA刺激,72 h后采用MTT法检测各组小鼠脾细胞的增殖能力。免疫保护率结果显示,glpK缺失株可对免疫小鼠提供100%的保护率,而攻菌对照组小鼠在攻菌后12 d全部死亡。脾脏指数和载菌量检测结果显示,与对照组相比,免疫后3d、10 d和21 d的免疫组小鼠脾脏指数均极显著升高(0.001<P<0.01),且10 d时脾脏指数最高;小鼠脾脏载菌量逐渐降低,并在免疫后21 d脾脏细菌被完全清除。血清抗体检测结果显示,免疫组小鼠抗体水平随免疫次数的增加而升高,而对照组小鼠血清抗体一直为阴性。淋巴细胞增殖能力检测结果显示,c50336ΔglpK全菌蛋白刺激的小鼠脾细胞增殖指数随免� 展开更多

关键词 甘油激酶GlpK 基因缺失株 疫苗

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布鲁菌S19疫苗株znuA单基因及bp26/znuA双基因缺失株的构建及鉴定 被引量：1

14

作者 马思思 王佳莹 +4 位作者 刘翠翠 丁红星 吴云燕 赵明秋 陈金顶 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期418-424,共7页

通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测... 通过等位基因交换,分别敲除牛流产型布鲁菌减毒活疫苗S19株和缺失株S19-Δbp26的znuA基因,构建了布鲁菌znuA基因单缺失株S19-ΔznuA和bp26、znuA基因双缺失株S19-Δbp26-ΔznuA,对获得的2种缺失株进行形态学、生长特性、稳定性和基因测序验证。结果表明,S19株和S19-Δbp26株的znuA基因均成功缺失,生长特性表示2种缺失株与亲本株生长基本无差异;体外连续传至20代,菌落PCR鉴定及基因测序结果显示2种缺失株均遗传稳定。牛流产型布鲁菌单缺失株S19-ΔznuA和双缺失株S19-ΔznuA-Δbp26的成功构建为布鲁菌新型疫苗的研发、布鲁菌感染动物过程中ZnuA蛋白的作用机理及其与Bp26蛋白之间关系的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁菌 znuA基因 基因缺失株

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布鲁氏菌2308ery基因启动子缺失株的构建及鉴定 被引量：1

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作者 孟仁 陈创夫 +4 位作者 张辉 王远志 郭飞 鲁芝子 李瑞芳 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期9-13,共5页

目的:构建布鲁氏菌2308株ery基因启动子缺失株。方法:用PCR方法从亲本株2308上扩增ery基因启动子侧翼序列,将该片段与pMD19-T连接,亚克隆为自杀载体pGEM-7zf-Δery-sacB。将自杀载体电转化布鲁氏菌感受态细胞中经同源重组后,分别用100 m... 目的:构建布鲁氏菌2308株ery基因启动子缺失株。方法:用PCR方法从亲本株2308上扩增ery基因启动子侧翼序列,将该片段与pMD19-T连接,亚克隆为自杀载体pGEM-7zf-Δery-sacB。将自杀载体电转化布鲁氏菌感受态细胞中经同源重组后,分别用100 mg/L氨苄和7%蔗糖筛选。对获得的基因缺失株进行RT-PCR鉴定和遗传稳定性检测。结果:成功获得ery基因启动子缺失株,2308Δery基因启动子缺失株未扩增出eryA基因。并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。结论:成功构建2308Δery基因启动子缺失株,为研究布鲁氏菌的毒力基因及其流产机制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 ery 基因敲出 基因缺失株 反转录PCR

原文传递

LPXTG基序蛋白lmo0159基因缺失株的构建及对单增李斯特菌环境适应能力的影响 被引量：1

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作者 张奇文 凌晨 +4 位作者 杜冬冬 钱凌霄 李红欢 薄新文 马勋 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第2期133-139,共7页

单增李斯特菌(LM)是一种重要的食源性致病菌,能引发人和动物李氏杆菌病,其细胞壁表面LPXTG基序蛋白在LM致病过程中发挥重要作用。为了探讨LPXTG基序蛋白Lmo0159对LM环境适应能力的影响,本研究利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)及同源重组技... 单增李斯特菌(LM)是一种重要的食源性致病菌,能引发人和动物李氏杆菌病,其细胞壁表面LPXTG基序蛋白在LM致病过程中发挥重要作用。为了探讨LPXTG基序蛋白Lmo0159对LM环境适应能力的影响,本研究利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)及同源重组技术,运用穿梭质粒p KSV7载体,构建lmo0159基因缺失株LM90SB2-lmo0159。测定在不同温度、不同Na Cl浓度及3.5%乙醇环境下OD600,绘制生长曲线。结果显示:在4℃条件下,LM90SB2与LM90SB2-lmo0159生长无差异;在37和42℃条件下,LM90SB2-lmo0159的生长速度显著低于LM90SB2(P<0.05);在含2.5%Na Cl的BHI培养基中,LM90SB2-lmo0159的生长受到明显抑制,显著低于LM90SB2(P<0.05);在含4.5%Na Cl和3.5%乙醇的BHI培养基中,LM90SB2和LM90SB2-lmo0159生长均受到一定程度抑制,但在4.5%Na Cl条件下差异不显著(P>0.05),在3.5%乙醇条件下,LM90SB2-lmo0159的生长低于LM90SB2,差异显著(P<0.05)。本研究表明lmo0159基因对LM适应胁迫环境具有一定的影响,为进一步研究lmo0159基因的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 lmo0159基因 缺失株 同源重组 环境适应性

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布鲁菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的构建及毒力和免疫原性的评估

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作者 刘翠翠 马思思 +4 位作者 王佳莹 吴云燕 易琳 赵明秋 陈金顶 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期18-25,共8页

【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化... 【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化法,将含有znuA基因上下游同源臂的自杀质粒转入到亲本株中,通过同源重组敲除znuA基因.对构建的新型基因缺失株进行生物学特性及毒力的鉴定与分析.【结果和结论】PCR及核苷酸序列测序结果表明,羊种布鲁菌减毒活疫苗znuA单基因缺失株和bp26、znuA双基因缺失株均构建成功,分别将其命名为M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.与亲本株相比,2种缺失突变株的生物学特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA株具有良好的遗传稳定性.小鼠脾脏质量和脾脏菌落数表明,M5-Δbp26-ΔznuA双基因缺失株毒力最弱,单基因缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26次之.血清中抗体水平的监测显示,znuA基因的缺失对布鲁菌减毒活疫苗诱导机体体液免疫的能力没有影响.获得了免疫原性保持良好而毒力减弱的羊种布鲁菌减毒活疫苗基因突变株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA. 展开更多

关键词 布鲁菌 znuA基因 基因缺失株 毒力 免疫原性

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猪布鲁菌S2 omp10基因缺失株的构建及特性

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作者 杨艳北 韩文瑜 孙长江 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2011年第8期12-15,共4页

现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用。本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷。... 现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用。本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷。本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株。分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力。结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性。与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱。表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 猪布鲁菌 omp10 基因缺失株

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布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：4

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作者 邱润辉 关飞虎 +7 位作者 王梓行 郭嘉 朱德馨 张伟 魏春燕 霍明凯 孙志华 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1630-1640,共11页

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合... 【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMCO基因缺失株 生长曲线 胞内生存

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应用CRISPR/Cas9系统构建大肠埃希氏菌irp2基因缺失株 被引量：5

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作者 富国文 单春兰 +4 位作者 敖平星 赵汝 高丽波 刘超英 高洪 《动物医学进展》 北大核心 2021年第1期50-55,共6页

CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sg... CRISPR/Cas9是一个新兴的基因编辑技术,利用该技术对临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中的irp2基因进行编辑,为进一步研究该基因在致病中的作用提供基础。首先构建靶向irp2基因的sgRNA,PCR扩增上、下游同源臂,利用重叠PCR技术连接sgRNA与上、下游同源臂,再通过酶切与酶连构建出靶向irp2基因的pTargetF重组质粒。将pCas与pTargetF重组质粒转化临床分离的撒坝猪致病性大肠埃希氏菌中,成功构建了该菌株的irp2基因缺失菌株,为进一步研究其致病机制奠定基础。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 大肠埃希氏菌 irp2基因缺失菌株

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