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重组人早孕因子的表达与纯化 被引量：6
1
作者 杜晓明 张改平 +5 位作者 王丽 郭军庆 王林林 冯华 权凯 王爱萍 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2011年第14期40-44,共5页
早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,通过PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆... 早孕因子(EPF)是具有免疫抑制和生长调节活性的妊娠相关蛋白,为目前最早确认妊娠的生化指标之一。为获得人早孕因子重组蛋白,通过PCR技术扩增人早孕因子基因,克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,与GST基因相融合,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌表达菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,以SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白的表达,通过GST树脂纯化表达蛋白。结果成功构建重组表达质粒pGEX6P-EPF,在大肠杆菌中诱导表达了GST-EPF融合蛋白,表达蛋白分子量为37.3kDa,并能被抗GST单克隆抗体特异识别,GST亲和层析纯化,制备了EPF重组蛋白。 展开更多
关键词 早孕因子 原核表达 重组蛋白
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重组早孕因子(EPF)的表达、纯化及鉴定 被引量：4
2
作者 练玉银 王家骥 《生殖与避孕》 CAS CSCD 2012年第3期156-160,共5页
目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过I... 目的:获取大量具有良好生物活性的早孕因子(EPF)重组蛋白。方法:从HeLa细胞中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增EPF cDNA,将该cDNA插入载体pGEX-5X-1,获得重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF,将重组表达质粒pGEX-5X-1/EPF转化大肠杆菌BL21后通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析方法,分离纯化得到纯重组GST-EPF融合蛋白(rEPF)。再用Xa酶切GST,得到纯化的EPF重组蛋白。用SDS-PAGE鉴定其纯度,用Western blotting鉴定其特异性,用玫瑰花环抑制试验(RIT)检测其生物学活性。结果:HeLa细胞总RNA中有效扩增出EPF cDNA。EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pGEX-5X-1,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白。Western blotting表明其与抗EPF抗体有特异性结合,RIT检测结果显示目的蛋白具有良好的EPF生物学特性。结论:成功构建了EPF的原核表达载体,并纯化获得了具有生物学特性的重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究奠定了基础。 展开更多
关键词 早孕因子(epf) 表达 纯化 特性鉴定
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孕牛血清中早孕因子的分离纯化 被引量：2
3
作者 赵明 孙文东 +5 位作者 努尔.波拉提 邓雁如 吴瑞英 迈迪娜 王祥 石国良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期129-133,共5页
采用DEAE Sepharose(DEAE 琼脂糖凝胶 )、CM Sepharose(CM 琼脂糖凝胶 )等离子交换层析、抗孕牛全血清IgG Sepharose 4B亲和层析等技术 ,分离纯化妊娠 4～ 5个月健康孕牛全血清中的早孕因子 (EPF) ,用玫瑰花环抑制实验对各阶段产物EPF... 采用DEAE Sepharose(DEAE 琼脂糖凝胶 )、CM Sepharose(CM 琼脂糖凝胶 )等离子交换层析、抗孕牛全血清IgG Sepharose 4B亲和层析等技术 ,分离纯化妊娠 4～ 5个月健康孕牛全血清中的早孕因子 (EPF) ,用玫瑰花环抑制实验对各阶段产物EPF活性进行检测。结果显示 ,经层析过柱后的CM ⅡA提取物有EPF活性。经SDS PAGE银染显色证实它含有分子量为 2 1、6 7、80KD的蛋白 ,实验结果支持 2 1KD的多肽为主要EPF活性物成分。同时实验表明了亲和层析对进一步纯化EPF是可行的。 展开更多
关键词 孕牛血清 早孕因子 分离纯化 玫瑰花环抑制滴度
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牦牛EPF的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3
4
作者 曹艳桃 樊江峰 +5 位作者 余四九 周应聪 杜培岩 李一娟 马进彪 赵生贤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期470-480,共11页
本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础。采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His... 本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础。采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒,经PCR和测序鉴定后将阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达并优化表达条件,使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫小鼠制备抗体。结果显示,经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右,符合预期结果,并通过测序验证获得重组阳性质粒。pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经IPTG的诱导,表达分子质量大小为29 ku的蛋白(其中包括早孕因子目标蛋白和SUMO标签蛋白),且在37℃、IPTG浓度为300 nmol·L^(-1)、诱导6 h时获得最高表达量。Western blot结果显示,蛋白在上清和包涵体中均有表达,免疫后的小鼠抗血清能够与纯化后的重组蛋白发生免疫反应。本试验通过原核表达系统成功表达了重组牦牛EPF蛋白,制备了免疫原性较好的鼠抗EPF多克隆抗体。 展开更多
关键词 牦牛 早孕因子(epf) 原核表达 多克隆抗体
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孕妇血清中早孕因子的纯化及其部分特性研究 被引量：2
5
作者 徐振山 苏宝田 +1 位作者 史敏言 谭福莱 《蚌埠医学院学报》 CAS 1991年第3期164-167,共4页
采用DEAE纤维素(Whatman产)柱层析Sephadex G-100凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(Disc-PAGE)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶平板电泳(SDS-PAGE)对50例妊娠3～8周妇女混合血清中早孕因子(EPF)进行纯化提取及部分特性研究,并采用花结抑制试验(Ea... 采用DEAE纤维素(Whatman产)柱层析Sephadex G-100凝胶过滤、聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(Disc-PAGE)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶平板电泳(SDS-PAGE)对50例妊娠3～8周妇女混合血清中早孕因子(EPF)进行纯化提取及部分特性研究,并采用花结抑制试验(Ea-RIT)检测EPF活性,结果表明:(1)EPF存在于早孕妇女血清中;(2)早孕血清中EPF的活性形式主要为21.2KD、26.3KD的蛋白多肽;(3)EPF有明显的免疫抑制活性。 展开更多
关键词 早孕因子 花结抑制试验 孕妇
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鼠抗早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：2
6
作者 练玉银 吴晓亮 +2 位作者 王家骥 温志锋 聂湘辉 《中国热带医学》 CAS 2012年第5期532-534,共3页
目的制备鼠抗早孕因子(EPF)单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效... 目的制备鼠抗早孕因子(EPF)单克隆抗体,纯化并进行鉴定。方法用重组EPF免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术获得抗EPF杂交瘤细胞株,注入BALB/c小鼠腹腔制备腹水型单抗,Protein-G亲和层析纯化后,SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,用间接ELISA法测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,用Western blotting鉴定其特异性,并进行类及亚类、细胞染色体核型分析。结果筛选出2株具有较高活性和良好稳定性的分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水的抗体效价均高于2×10-5,2株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,2株单抗有不同的抗原表位。SDS-PAGE电泳显示纯化后抗体有较高的纯度,Western blotting表明其与EPF抗原有特异结合性。结论成功制备2株具有较高活性的鼠抗EPF单克隆抗体,为建立检测EPF方法奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 早孕因子 单克隆抗体 鉴定
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Hela细胞早孕因子基因的克隆与原核表达
7
作者 郑玮璐 刘为民 +4 位作者 陈芳 王丙云 梁梓森 计慧琴 谢莹佳 《动物医学进展》 北大核心 2015年第5期11-15,共5页
为了获取大量具有免疫原性的早孕因子(EPF)重组蛋白,通过PCR技术扩增得到Hela细胞EPF基因片段,与pREST-A连接。将质粒pREST-A-EPF转化大肠埃希菌BL21后IPTG进行诱导表达,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,再用SDS-PAGE和Western... 为了获取大量具有免疫原性的早孕因子(EPF)重组蛋白,通过PCR技术扩增得到Hela细胞EPF基因片段,与pREST-A连接。将质粒pREST-A-EPF转化大肠埃希菌BL21后IPTG进行诱导表达,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,再用SDS-PAGE和Western blot分别鉴定其纯度和特异性。结果表明,EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pREST-A,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白,Western blot表明其与抗EPF抗体特异性结合。论文构建了EPF的原核表达载体,纯化获得了重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究和猪早孕诊断试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 早孕因子 表达 纯化 特性鉴定
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EPF单抗联合顺铂对家畜膀胱肿瘤抑瘤效果的影响——基于膀胱肿瘤裸鼠移植瘤模型
8
作者 钟永怡 周泉 +3 位作者 苏立杰 练玉银 王家骥 陈骁熠 《湖北农业科学》 2020年第9期133-136,共4页
为观察早孕因子单克隆抗体(EPF-McAb)联合顺铂(DDP)对膀胱癌细胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用,常规将EJ细胞接种于裸鼠右侧背部皮下,待肿瘤长至直径约5 mm时随机分为4组,每组5只,即空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组... 为观察早孕因子单克隆抗体(EPF-McAb)联合顺铂(DDP)对膀胱癌细胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用,常规将EJ细胞接种于裸鼠右侧背部皮下,待肿瘤长至直径约5 mm时随机分为4组,每组5只,即空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组。定期测量裸鼠肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。给药2周后处死裸鼠,剥取肿瘤,称瘤重,计算抑瘤率。通过苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察细胞病理学改变;免疫印迹法检测早孕因子(EPF)的表达情况。结果表明,顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠移植瘤生长速度均慢于空白对照组。与顺铂组比较,低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠末次给药的移植瘤体积分别为(131.05±8.26)和(97.92±7.35)mm^3。低剂量单抗联合组抑瘤率(35.78%)和高剂量单抗联合组抑瘤率(53.04%)均高于顺铂组抑瘤率(22.36%),差异均达显著水平(P<0.05)。与空白对照组比较,单抗联合组裸鼠EPF蛋白的表达量下降(P<0.05)。表明EPF-McAb联合顺铂可抑制膀胱癌细胞EJ在裸鼠体内增殖,其机制可能通过抑制EPF的表达发挥作用。 展开更多
关键词 早孕因子单克隆抗体(epf-McAb) 顺铂 膀胱肿瘤 家畜
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