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36型人腺病毒E4ORF1真核表达载体的构建及其促进前脂肪细胞3T3-L1对葡萄糖利用的作用初探
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作者 王冰丽 陈哲 +3 位作者 艾柯代姆·阿卜杜克热木 刘迪晖 赵炳尧 关亚群 《新疆医科大学学报》 CAS 2022年第5期469-478,共10页
目的通过构建早期基因4开放读码框1(E4ORF1)真核表达载体,探讨E4ORF1蛋白调节前脂肪细胞3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)利用葡萄糖的作用。方法通过分子克隆技术构建pcDNA3.1-E4ORF1重组质粒,并进行DNA测序鉴定。将前脂肪细胞3T3-L1分为对... 目的通过构建早期基因4开放读码框1(E4ORF1)真核表达载体,探讨E4ORF1蛋白调节前脂肪细胞3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)利用葡萄糖的作用。方法通过分子克隆技术构建pcDNA3.1-E4ORF1重组质粒,并进行DNA测序鉴定。将前脂肪细胞3T3-L1分为对照组和E4ORF1转染组,检测两组细胞第0、1、2、3天培养基中葡萄糖浓度,利用RT-qPCR和Western-Blot检测两组细胞第0、1、2、3、4天E4ORF1、己糖激酶2(HK2)、糖原合酶1(GYS1)mRNA和蛋白质的表达情况。油红O染色观察两组细胞第0、1、2、3、4天分化及脂质积累情况,检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白a(C/EBPa)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)mRNA和蛋白质的表达情况。结果成功构建N端带FLAG(DYKDDDDK肽)标签的真核表达载体pcDNA3.1-E4ORF1。与对照组相比,E4ORF1转染组细胞培养基中葡萄糖浓度随培养时间延长下降更快,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-qPCR和Western-Blot结果显示,与对照组相比,转染组E4ORF1的mRNA和蛋白表达水平均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。E4ORF1转染组的糖酵解关键酶基因HK2和糖原合酶基因GYS1 mRNA和蛋白质的表达均显著上升(P均<0.05)。油红O染色显示两组细胞均无成脂分化现象,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPa、FABP4、FASN、ACC的mRNA和蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。结论成功构建pcDNA3.1-E4ORF1真核表达载体;在前脂肪细胞3T3-L1中,E4ORF1可能通过促进HK2和GYS1的表达,参与细胞对葡萄糖的分解和糖原合成过程,对前脂肪细胞的分化无影响。 展开更多
关键词 36型人腺病毒 早期基因4开放读码框1 己糖激酶 前脂肪细胞3T3-L1 糖代谢
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