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鹅星状病毒与新型鸭呼肠孤病毒双重RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 张景辉 武景琦 +10 位作者 房立春 刘涛 吴家强 于可响 徐怀英 吕俊峰 艾武 郭慧君 邱建华 亓丽红 宋玲玲 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期749-756,共8页
根据鹅星状病毒(GAstV)ORF1b基因与鹅源新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)σC基因的保守序列设计特异性引物,建立GAstV与NDRV双重RT-PCR检测方法,该方法具有较高的特异性,在903 bp(GAstV)和226 bp(NDRV)可检测到特异性条带,最低灵敏度为1.0×1... 根据鹅星状病毒(GAstV)ORF1b基因与鹅源新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)σC基因的保守序列设计特异性引物,建立GAstV与NDRV双重RT-PCR检测方法,该方法具有较高的特异性,在903 bp(GAstV)和226 bp(NDRV)可检测到特异性条带,最低灵敏度为1.0×10^(3)copies/μL。在鲁中、鲁西北及鲁南地区不同规模的养鹅场中随机采取320份样本,GAstV的阳性率为21.56%(69/320),NDRV的阳性率为3.44%(11/320),混合感染阳性率为2.81%(9/320),单一RT-PCR结果与双重RT-PCR方法一致。该方法的建立为快速诊断GAstV和NDRV提供了可靠的手段。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 鹅源新型鸭呼肠孤病毒 双重rt-pcr
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苹果茎痘病毒双重RT-PCR检测体系的建立及应用 被引量:3
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作者 胡国君 董雅凤 +3 位作者 张尊平 范旭东 任芳 张梦妍 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期428-432,共5页
病毒病是危害苹果(Malus domestica)的一类重要病害。已报道的苹果病毒种类很多,在我国发生普遍的主要有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple... 病毒病是危害苹果(Malus domestica)的一类重要病害。已报道的苹果病毒种类很多,在我国发生普遍的主要有苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApM V)以及苹果锈果类病毒(Apple scar skid viroid,ASSVd)[1~3]。 展开更多
关键词 APPLE APPLE stem PITTING VIRUS dual rt-pcr VIRUS detection
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猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立 被引量:3
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作者 谭飞 马士博 +6 位作者 王瑞翀 张希 姜艳平 崔文 孟柳 尹纪元 乔薪瑗 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期28-30,共3页
本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术... 本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 双重rt-pcr 猪瘟 猪流行性腹泻
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双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究 被引量:2
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作者 张妙彬 潘丽晶 +1 位作者 肖杨 杨玉环 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期166-167,180,共3页
以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建... 以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。 展开更多
关键词 兰花 双重rt-pcr 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 检测
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PEDV、TGEV二重RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量:1
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作者 陈希文 杨双燕 +6 位作者 李莲 尹苗 杨勤 杨凤 罗文涛 马缨 赵洪 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第11期138-142,共5页
为了能快速灵敏地确诊临床腹泻仔猪的病原,试验采用分子生物学方法对基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因(KJ778616.1)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因(GQ374566.1)的二重RTPCR检测方法进行了研究。结果表明:建立的二重RT-PCR检... 为了能快速灵敏地确诊临床腹泻仔猪的病原,试验采用分子生物学方法对基于猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因(KJ778616.1)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因(GQ374566.1)的二重RTPCR检测方法进行了研究。结果表明:建立的二重RT-PCR检测方法能同时扩增鉴别PEDV和TGEV两个病原;该方法的特异性强,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪轮状病毒(PoRV)等病毒间不存在交叉反应;敏感性高,PEDV的最低稀释度为1×10^-5,TGEV的最低稀释度为1×10^-4;应用建立的方法对36份临床腹泻仔猪粪便拭子、小肠组织和乳汁等样品进行检测,结果与商品化试剂盒的符合率为100%。说明试验成功建立了能同时检测并鉴别PEDV和TGEV的二重RT-PCR方法,该方法快速、准确、灵敏,在临床发病样品中应用效果良好,适合在疑似PEDV和TGEV发病猪场中推广应用。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 二重rt-pcr 鉴别诊断 建立 应用
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DUOX2在银屑病及特应性皮炎皮损表达的研究
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作者 周蓉颖 万逸枫 +2 位作者 郭昱 蒋献 吴琦 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期736-739,746,共5页
目的探讨双功能氧化酶(dual oxidase,DUOX)2在寻常型银屑病患者皮肤、特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者皮肤及正常人皮肤中的表达定位及差异,探讨其在皮肤抗感染机制中的作用。方法免疫组化法检测银屑病皮损区、银屑病非皮损区、A... 目的探讨双功能氧化酶(dual oxidase,DUOX)2在寻常型银屑病患者皮肤、特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者皮肤及正常人皮肤中的表达定位及差异,探讨其在皮肤抗感染机制中的作用。方法免疫组化法检测银屑病皮损区、银屑病非皮损区、AD皮损区、AD非皮损区皮肤及正常皮肤DUOX2蛋白的表达。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测寻常型银屑病患者皮损区、AD皮损区及正常皮肤中DUOX2mRNA表达水平。结果免疫组化法检测结果显示,DUOX2蛋白在银屑病皮损区、银屑病非皮损区、AD皮损区、AD非皮损区皮肤及正常皮肤标本中均有表达,并主要分布在表皮基底层、棘层与真皮乳头层。银屑病皮损组较银屑病非皮损组及正常皮肤组表达增加(P<0.01);AD皮损组较AD非皮损组及正常皮肤组表达增加(P<0.01);AD皮损组较银屑病皮损组表达增加(P<0.01)。RT-PCR法检测到DUOX2mRNA在银屑病皮损及AD皮损中有表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DUOX2在寻常型银屑病皮损、AD皮损及正常皮肤中表达,提示DUOX2可能参与皮肤抗感染机制,发挥抗菌屏障功能及氧化防御作用。 展开更多
关键词 银屑病 特应性皮炎 DUOX2 免疫组化 rt-pcr
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应用DPO引物检测马铃薯病毒的多重RT-PCR技术研究 被引量:27
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作者 刘梅 黄新 +2 位作者 马占鸿 陈洪俊 李明福 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期431-434,共4页
DPO is one of the new specific primers for virus detection.In this study,five sets of dual priming oligonucleotide(DPO) primers for Potato virus X(PVX),Potato virus Y(PVY),Potato virus V(PVV),Tobacco ring spot virus(T... DPO is one of the new specific primers for virus detection.In this study,five sets of dual priming oligonucleotide(DPO) primers for Potato virus X(PVX),Potato virus Y(PVY),Potato virus V(PVV),Tobacco ring spot virus(TRSV) and Cucumber mosaic virus(CMV) were designed and applied to the detection of the main potato viruses with multiplex reverse transcription polymerase chain reaction(m-RT-PCR),including two quarantine viruses in China(PVV and TRSV).The results showed that DPO-m-RT-PCR exhi-bited high PCR specificity and sensitivity even under less than optimal PCR condition compared with conventional m-RT-PCR.DPO-m-RT-PCR could be applied in the healthy evaluation of seed potato and its exit-entry quarantine. 展开更多
关键词 马铃薯病毒 病毒检测技术 pcr技术 检疫性有害生物 DPO rt 多重 引物
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应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法 被引量:20
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作者 徐焕洲 平芮巾 +5 位作者 季汝武 王琳 杨鹏飞 张丽萍 岳启安 胡孔新 《中国国境卫生检疫杂志》 CAS 2012年第2期73-77,共5页
目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encepha... 目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。 展开更多
关键词 DPO引物 多重rt-pcr 日本脑炎病毒 黄热病毒 西尼罗病毒 圣路易斯脑炎病毒 登革病毒
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牛病毒性腹泻病毒和牛冠状病毒双重纳米RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:7
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作者 魏宇 王海璐 +3 位作者 孙飞雁 郭利 程悦宁 王全凯 《畜牧与兽医》 北大核心 2022年第3期101-105,共5页
本文建立了一种同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)2种病原的双重纳米RT-PCR方法。采用BVDV 5′-UTR基因序列(GenBank登录号:AB040132.1)和BCoV的N基因保守序列(GenBank登录号:KX982264.1)设计出一对BVDV特异性引物和一... 本文建立了一种同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)2种病原的双重纳米RT-PCR方法。采用BVDV 5′-UTR基因序列(GenBank登录号:AB040132.1)和BCoV的N基因保守序列(GenBank登录号:KX982264.1)设计出一对BVDV特异性引物和一对BCoV的特异性引物,结果表明此方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和牛轮状病毒(BRV)均无交叉反应,特异性良好。同时,应用此方法检测33份腹泻牛的临床样品和25份腹泻鹿的临床样品,结果得出BVDV、BCoV和2种病原混合感染的牛样品阳性率分别为15.15%、36.36%和6.06%。鹿样品感染BVDV、BCoV和2种病原混合感染的阳性率分别为28%、8%和8%。此外,敏感性试验结果为常规RT-PCR敏感性的10倍,最低检出限为1 fg。研究表明,本文建立的该方法快速、灵敏、简捷,具有较强的特异性、敏感性,可适用于大批量临床样品检测,为反刍动物相关病毒性腹泻的诊断和防控提供一定技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒腹泻病毒 牛冠状病毒 双重纳米rt-pcr
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犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:4
10
作者 徐航 任建炜 +2 位作者 于德涛 曹志 温建新 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期379-384,共6页
为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV ... 为建立鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)和犬冠状病毒(CCoV)的方法,本研究采用PCR方法分别扩增CDV N基因和CCoV S基因,并克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒pCDV-N、pCCoV-S,均经PCR和测序鉴定后测定浓度作为质粒标准品。同时针对CDV N基因和CCoV S基因设计特异性引物和TaqMan探针,采用方阵试验对各反应条件的优化,建立了同时检测这两种病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。利用10倍倍比稀释的质粒标准品按照该方法检测,建立标准曲线,结果显示,两个重组质粒标准品均与各自的Ct值具有良好的线性关系。采用该方法分别检测CDV、CCoV、犬细小病毒、犬传染性喉气管炎病毒2型、犬副流感病毒,评估该方法的特异性;将两种质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后,取108~101稀释度的质粒混合物作为模板,采用该方法检测,评估该方法的敏感性;将两种质粒标准品10倍倍比稀释并等体积混合后,分别取107、105、103稀释度的质粒标准品混合物采用该方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,该方法仅能特异性扩增CDV和CCoV,与犬的其他病毒均无交叉反应,特异性较强;对CDV质粒标准品的检测限为5.0×103拷贝/μL,对CCoV质粒标准品的检测限为4.93×103拷贝/μL,敏感性较高;组内和组间的变异系数均小于3%,重复性较好。利用本实验建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法和已报道的CCoV RT-PCR及国标规定的CDV RT-PCR方法同时检测采集的100份临床腹泻犬样品,结果显示,共检出35份阳性样品,其中,CDV的阳性检出率为16%(16/100),CCoV的阳性检出率为19%(19/100),阴性样品65份,与CCoV和CDV参考方法的检测结果均一致。本研究建立的CDV和CCoV双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可在40 min内完成检测,且准确、快速、敏感,为CDV和CCoV临床大量样品的快速和特异性鉴别检测提供了有效技术手段。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 犬冠状病毒 双重荧光定量rt-pcr
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Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分 被引量:9
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作者 金萍 结莉 +2 位作者 陆俊 陈英 丁洪流 《肉类研究》 北大核心 2016年第9期17-22,共6页
目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设... 目的:建立一种能实时同步检测动物源性食品中猪肉源性和鸡肉源性成分的Taqman探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,应用于动物源性食品的成分掺假快速检验。方法:分别依据猪和鸡的种间保守基因(Cytb)序列设计、合成特异性引物及不同荧光标记(FAM、HEX)的Taqman探针,建立可同步检测动物源性食品中的猪源性和鸡源性成分的Taqman探针双重荧光PCR方法。结果:所建立的Taqman探针双重荧光PCR检测方法特异性强,仅对猪、鸡成分有扩增;灵敏度高,最低检测到猪源、鸡源DNA的含量分别为0.02、0.10 ng;抗干扰性强,当DNA混样中猪源、鸡源性成分含量在2%以上水平时,所建立的混合检测体系均能对DNA混样给出正确判断。结论:所建立的混合检测体系具有高特异性、高灵敏度,能够适用于动物源性食品中猪肉、鸡肉成分的同时快速检测。 展开更多
关键词 双重荧光聚合酶链式反应 动物源性食品 猪源性成分 鸡源性成分
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BVDV一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:8
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作者 王建昌 王金凤 +2 位作者 崔元 刘立兵 袁万哲 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期245-251,共7页
为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据OenBank已发表的BVDV1和BVDV25’UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双... 为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据OenBank已发表的BVDV1和BVDV25’UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双重荧光RT-PCR方法。结果显示,双重荧光RT—PCR对BVDV1和BVDV2的检测下限均为10^2拷贝;具有较强的特异性,对口蹄疫病毒、猪瘟病毒、Hobi样病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、施马伦贝格病毒等病毒核酸的扩增均为阴性;BVDV1和BVDV2的扩增均在10^2~10^7拷贝内呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数(R^2)分别为0.999和0.998;方法重复性好,BVDV1和BVDV2的变异系数(CV值)分别在0.68%~1.87%和1.25%~1.900A。本试验对665份样品进行检测,共检出BVDV阳性样品45份,其中BVDV1阳性样品39份,BVDV2阳性样品5份,BVDV1和BvDv2均阳性样品1份。结果表明,本试验建立的BVDV一步法双重荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可广泛应用于BVDV的快速检测、分型和流行病学调查。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 一步法 双重荧光rtpcr 检测 分型
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基于DPO引物检测猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用 被引量:6
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作者 王以欣 王紫薇 +8 位作者 汉武娇 王丽 姜艳平 崔文 周晗 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 徐义刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期710-715,共6页
为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种... 为建立快速、准确检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究以PEDV的N基因为靶基因,基于双启动寡核苷酸引物(DPO),经过条件优化,建立了检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法。结果显示,DPO引物的有效退火温度范围较宽(45℃~65℃);在测试的10种病毒中仅PEDV为阳性扩增结果,其余病毒为阴性结果,特异性较强;对PEDV质粒标准品的检测限可达1.64×10^1拷贝/μL,敏感性较高;组内、组间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。利用该方法对采集的272份临床仔猪腹泻样品(粪便、小肠组织)进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品39份,阳性率为14.34%,与常规RT-PCR方法检测结果的阳性符合率为92.31%;本研究建立方法检测的阳性样品经PEDV N基因测序鉴定,确实均为PEDV阳性样品。本研究建立的基于DPO引物检测PEDV的荧光定量RT-PCR方法为PEDV的准确检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 DPO引物 荧光定量rt-pcr
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猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用 被引量:2
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作者 邹宏 夏应菊 +5 位作者 李玲 徐璐 赵俊杰 王团结 张乾义 宋振辉 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4422-4427,共6页
本研究旨在建立一种快速、高效、灵敏的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重鉴别荧光定量PCR检测方法,针对CSFV E2基因和BVDV 5′UTR基因序列的高度保守区域设计特异性引物和探针,经过反应条件及体系的优化,建立双重RT-qPCR方... 本研究旨在建立一种快速、高效、灵敏的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重鉴别荧光定量PCR检测方法,针对CSFV E2基因和BVDV 5′UTR基因序列的高度保守区域设计特异性引物和探针,经过反应条件及体系的优化,建立双重RT-qPCR方法。结果表明,该方法最低检测值均为5 copies·μL^(-1),比普通PCR灵敏约200倍,敏感性高;可准确区分CSFV和BVDV,且与口蹄疫病毒、猪伪狂犬病病毒等猪常见病原均无交叉反应,特异性强;组内和组间重复变异系数均小于2%,重复性良好。对109份临床样品及7份商品化牛血清分别采用构建的双重RT-qPCR检测方法及CSFV RT-qPCR检测方法(GB/T 27540—2011)和BVDV RT-qPCR检测方法(GB/T 18637—2018)进行检测和对比,符合率为100%,同时,检测结果还证实目前商品化牛血清中仍存在BVDV污染,为CSFV、BVDV的鉴别诊断及流行病学的调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 牛流行性腹泻病毒 双重荧光定量pcr
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DPO引物多重RT-PCR技术检测甲型流感病毒的研究 被引量:5
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作者 徐昌平 卢亦愚 《浙江预防医学》 2013年第1期5-7,16,共4页
目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H... 目的应用DPO引物技术建立一种可以同时检测新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1、H3N2以及禽流感病毒H5N1的单管多重RT-PCR检测方法,为流行性感冒的监测与应急诊断提供高通量检测技术。方法应用DPO引物技术设计针对新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1的高特异性DPO引物,并对多重RT-PCR反应体系优化,建立多重RT-PCR检测技术。结果建立的多重RT-PCR方法可同时扩增新甲型流感病毒H1N1221 bp、季节性流感病毒H1N1468 bp和H3N2592 bp以及禽流感病毒H5N1350 bp的基因片段。检测敏感性分别为102、102、103和102copies/ml,并与呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒等呼吸道病毒无交叉反应。结论本研究建立的多重RT-PCR可以同时准确分型新甲型流感病毒H1N1、季节性流感病毒H1N1和H3N2以及禽流感病毒H5N1,为流行性感冒的监测与应急诊断提供了有效的实验室检测手段。 展开更多
关键词 甲型流感病毒 DPO引物 多重rt-pcr
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猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制 被引量:4
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作者 余波 谭诗文 +3 位作者 冉懋韬 徐景峨 史开志 杨丽娟 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期152-154,180,共4页
根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结... 根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7 N基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV 0.2 ng/L、JEV 0.4 ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪乙型脑炎病毒 双重一步法rtpcr
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EGF/EGFR/ErbB2调控成釉细胞MMP-20基因表达的研究 被引量:3
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作者 曲政 王玉敏 +3 位作者 李博涵 许针针 袁杰 高玉光 《牙体牙髓牙周病学杂志》 CAS 北大核心 2013年第7期417-423,共7页
目的:研究EGF/EGFR/ErbB2信号通路对小鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(matrixmetalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用。方法:用定时定量RT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统分析EGF/EGFR/ErbB2调控MMP-20基因的表达、EGF调控MM... 目的:研究EGF/EGFR/ErbB2信号通路对小鼠成釉细胞中基质金属蛋白酶-20(matrixmetalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用。方法:用定时定量RT-PCR、双荧光素酶报告基因检测系统分析EGF/EGFR/ErbB2调控MMP-20基因的表达、EGF调控MMP-20启动子的主要区域、MAPK信号通路阻断剂对EGF调控MMP-20转录活性的影响、转录因子Jun家族介导EGF/ErbB2对MMP-20转录活性的调控;用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统分析EGF/ErbB2、C-Jun对MMP-20基因启动子转录活性的影响。结果:成釉细胞经20 ng/mL EGF刺激后,MMP-20的基因表达上调(P<0.05),MMP-20启动子在(-157~+23)之前的区域转录活性增强(P<0.05);EGFR、ErbB2、ERK阻断剂均能抑制EGF对MMP-20基因表达的调控(P<0.05);转录因子C-Jun介导EGFR/ErbB2上调MMP-20基因的表达(P<0.05);突变MMP-20启动子的AP1结合位点后,MMP-20基因表达的水平下降(P<0.05),同时EGF/ErbB2也失去上调MMP-20基因表达水平的作用。结论:在成釉细胞中EGF通过EGFR/ErbB2~ERK~C-Jun信号通路对MMP-20基因的表达起到调控作用。 展开更多
关键词 EGF EGFR ERBB2 基质金属蛋白酶-20 双荧光素酶基因检测 rt-pcr
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2种兰花主要病毒双重一步法RT-PCR检测的影响因素 被引量:3
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作者 黎园 吴竹妍 +3 位作者 孙洁 孙辉 向梅梅 饶雪琴 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第5期1205-1206,共2页
兰花是花卉产业最重要的观赏植物之一[1],一旦感染上病毒,其观赏价值和经济价值将受到严重影响。近年来,随着兰花产业的迅速发展,兰花国际国内贸易和种质交流十分频繁,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odon... 兰花是花卉产业最重要的观赏植物之一[1],一旦感染上病毒,其观赏价值和经济价值将受到严重影响。近年来,随着兰花产业的迅速发展,兰花国际国内贸易和种质交流十分频繁,建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)是严重影响兰花生产的2种主要病毒[2-3],有必要建立这两种病毒的高效检测方法。一些研究者对这2种病毒建立了双重RT-PCR检测方法[4-6],但对其检测体系的影响因素研究不多[5]。本试验对此进行了研究,旨在为兰花进出口贸易和安全生产奠定基础。 展开更多
关键词 建兰花叶病毒 齿兰环斑病毒 双重一步法rt-pcr
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双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用 被引量:3
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作者 许联红 岳玉林 +2 位作者 王永仿 楚鹰 蒋立新 《重庆医学》 CAS 北大核心 2016年第33期4688-4690,4741,共4页
目的建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法。方法设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用... 目的建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法。方法设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价。收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较。结果双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5TCID50/mL和0.05TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3%,总精密度均小于或等于4%;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性。109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4%;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000)。结论建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 手足口病 肠道病毒 肠道病毒71型 双重实时荧光rt-pcr
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双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平 被引量:2
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作者 姚霜 郑璐 +5 位作者 于洋 喻妙梅 潘丽莉 张俊 冯悦华 罗光华 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2015年第6期524-527,共4页
目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,... 目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法。方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成c DNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性。结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好。结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-αmRNA的定量检测。 展开更多
关键词 双重荧光定量pcr 肿瘤坏死因子-Α GAPDH
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