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题名飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位
被引量：2
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作者
宋慧芳
张建琴
范云鹤
李涛
马恩波
张建珍
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机构
山西大学应用生物学研究所
山西大学生命科学学院
农业有害生物综合治理山西省重点实验室
山西大学中医药现代研究中心
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出处
《中国农业科学》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第19期3704-3713,共10页
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基金
国家自然科学基金(31601697
31730074)
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文摘
【目的】双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme, dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一。本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据。【方法】通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2'、R3')进行后续的研究。根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的cDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH I、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L^(-1),37℃下诱导4 h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达。大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2'和R3'蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体。利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Western blot检测抗体的特异性。提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量。最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位。【结果】通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37%的序列一致度,选取特异的序列R2'和R3'设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD。在IPTG浓度为0.5 mmol·L^(-1)条件下,37℃诱导4 h后,目的蛋白在包涵体中大量表达。扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85%的R2'蛋白,可直接用于免疫;而R3'蛋白的纯度低于85%,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大�
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关键词
飞蝗
dsrna降解酶
多克隆抗体
组织定位
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Keywords
Locusta migratoria
dsrna degrading enzyme(dsrnase)
polyclonal antibody
subcelluar localization
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分类号
S433.2
[农业科学—农业昆虫与害虫防治]
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