目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基...目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。展开更多
为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本...为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本,进一步检测其粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平.80例样本中2种方法检测粉尘螨均为阳性的有65例,阳性率为81.3%.65例阳性样本中,Der f 1阳性率为87.7%,Der f 2阳性率为90.8%,二者至少一个为阳性的达96.99%,Der f 2特异性IgE水平显著高于Der f 1.儿童的粉尘螨及其2种单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平显著高于成人.综上,Der f 1和Der f 2这2种组分过敏原在我国粉尘螨患者中占据了主导地位,两者特异性IgE水平存在显著差异,后者高于前者,且儿童的敏感性显著高于成人.展开更多
目的探讨白细胞介素-33(IL-33)在粉尘螨1类变应原(Der f 1)诱导的过敏性哮喘小鼠中的变化及作用。方法将40只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分为哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和阴性对照组(PBS组),每组10只。哮喘组、免疫治疗组和抑制剂...目的探讨白细胞介素-33(IL-33)在粉尘螨1类变应原(Der f 1)诱导的过敏性哮喘小鼠中的变化及作用。方法将40只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分为哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和阴性对照组(PBS组),每组10只。哮喘组、免疫治疗组和抑制剂组分别在第0、7和14天腹腔注射100μl粉尘螨变应原提取液(含100μg/ml Der f 1),抑制剂组小鼠同时注射抑制剂(可溶性ST2 100μl,用于抑制IL-33),PBS组注射等量PBS。第21天起,各组小鼠雾化吸入粉尘螨变应原提取液(0.5μg/ml),30 min/次,1次/d,连续7 d。免疫治疗组小鼠第25天起于雾化前0.5 h,分别用200μl的Der f 1蛋白溶液(100μg/ml)腹腔注射进行免疫治疗,PBS组用PBS代替粉尘螨变应原。第27天雾化吸入后24 h处死小鼠,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和眼球血,并对BALF中嗜酸粒细胞进行计数,制作肺组织病理切片。ELISA法检测BALF中IL-5、IL-13和γ干扰素(IFN-γ)的含量及血清中特异性Ig E和Ig G2a水平。结果除PBS组小鼠外,其他组小鼠自第21天开始出现不同程度的哮喘症状。自第25天开始,免疫治疗组小鼠的哮喘症状开始缓解。哮喘组和PBS组小鼠BALF中嗜酸粒细胞总数分别为(4.41±0.36)×10~5/ml和(0.37±0.08)×10~5/ml,两组差异有统计学意义(t=24.50,P<0.01);免疫治疗组和抑制剂组小鼠的嗜酸粒细胞总数分别为(1.43±0.14)×10~5/ml和(2.73±0.33)×10~5/ml,均明显低于哮喘组(F=129.72,P<0.01)。ELISA检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组BALF中IFN-γ的水平分别为(83.06±11.38)、(277.97±22.46)、(175.13±13.41)和(224.77±19.97)pg/ml,免疫治疗组和抑制剂组均明显高于哮喘组(t=17.31,t=11.71,P<0.01)。哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组小鼠BALF中IL-5水平分别为(208.64±11.55)、(106.87±11.39)、(140.71±14.58)和(90.15±9.49)pg/ml,哮喘组的水平明显高于其他各组(F=97.19,P<0.01)。哮喘组和免疫治疗组BALF中IL-13水�展开更多
目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coliBL2...目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET-28a(+)-Der f 1,Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个。屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近。推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%。结论尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。展开更多
目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果...目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。展开更多
目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定...目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH5α,筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆,培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析;应用Lipo-fectamine 2000脂质体转染剂,重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法,以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Der p 1基因与Genbank上Der p 1cDNA全长序列完全一致,且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致;成功构建含Der p 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1,其能在真核细胞成功表达重组蛋白。展开更多
目的 建立一种能快速、准确检测环境中屋尘螨过敏原Der p 1基因的逆转录环介导等温扩增可视化(RT-LAMP)技术。方法 用Primer Explore 4.0对Der p 1基因进行RT-LAMP引物设计与筛选,提取屋尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨总RNA,利用...目的 建立一种能快速、准确检测环境中屋尘螨过敏原Der p 1基因的逆转录环介导等温扩增可视化(RT-LAMP)技术。方法 用Primer Explore 4.0对Der p 1基因进行RT-LAMP引物设计与筛选,提取屋尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨总RNA,利用优化的RT-LAMP反应体系分别扩增4个螨种的Der p 1基因,评价方法的特异度和灵敏度。采集74份哮喘患儿的床尘样品,提取总RNA进行Der p 1基因RT-PCR和RT-LAMP检测。结果 利用优化的RT-LAMP方法检测4种螨的Der p 1基因,只有屋尘螨阳性,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物呈现特征性梯形条带,肉眼和紫外灯下均观察到绿色荧光。建立的RT-LAMP对Der p 1基因的最小检测量为1.0×10^(-6 )μg,敏感性比常规RT-PCR高10倍;检测74份床尘样品,阳性率85.1%,与RT-PCR阳性率70.3%比较差异具有统计学意义(χ^(2)=4.72,P<0.05)。结论 建立的屋尘螨过敏原Der p 1基因RT-LAMP较常规RT-PCR灵敏度和特异性更高,可用于屋尘螨过敏原污染的快速检测。展开更多
文摘目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨I类变应原Der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总RNA,RT-PCR扩增Der f 1基因,克隆到T载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 1。工程菌经IPTG诱导培养,表达Der f 1目的蛋白。重组Der f 1蛋白通过6 His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行Western-Blot检测纯化的Der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中IgE的反应性,以鉴定重组Der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板,经RT-PCR从深圳地区克隆了4株Der f 1基因。该基因与GenBank公布的Der f 1(No.AB034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经IPTG诱导后高效表达的Der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。Western-Blot试验证实该4株Der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨I类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展Der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。
文摘为了解粉尘螨(Dermatophagoides farinae)过敏患者对粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE的水平情况,收集了80例疑似尘螨过敏患者样本,对ImmunoCAP过敏原检测系统和浙江大学迪迅粉尘螨检测试剂盒检测的粉尘螨特异性IgE阳性样本,进一步检测其粉尘螨单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平.80例样本中2种方法检测粉尘螨均为阳性的有65例,阳性率为81.3%.65例阳性样本中,Der f 1阳性率为87.7%,Der f 2阳性率为90.8%,二者至少一个为阳性的达96.99%,Der f 2特异性IgE水平显著高于Der f 1.儿童的粉尘螨及其2种单组分过敏原Der f 1和Der f 2特异性IgE水平显著高于成人.综上,Der f 1和Der f 2这2种组分过敏原在我国粉尘螨患者中占据了主导地位,两者特异性IgE水平存在显著差异,后者高于前者,且儿童的敏感性显著高于成人.
文摘目的探讨白细胞介素-33(IL-33)在粉尘螨1类变应原(Der f 1)诱导的过敏性哮喘小鼠中的变化及作用。方法将40只雌性BALB/c小鼠用随机数字表法分为哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和阴性对照组(PBS组),每组10只。哮喘组、免疫治疗组和抑制剂组分别在第0、7和14天腹腔注射100μl粉尘螨变应原提取液(含100μg/ml Der f 1),抑制剂组小鼠同时注射抑制剂(可溶性ST2 100μl,用于抑制IL-33),PBS组注射等量PBS。第21天起,各组小鼠雾化吸入粉尘螨变应原提取液(0.5μg/ml),30 min/次,1次/d,连续7 d。免疫治疗组小鼠第25天起于雾化前0.5 h,分别用200μl的Der f 1蛋白溶液(100μg/ml)腹腔注射进行免疫治疗,PBS组用PBS代替粉尘螨变应原。第27天雾化吸入后24 h处死小鼠,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和眼球血,并对BALF中嗜酸粒细胞进行计数,制作肺组织病理切片。ELISA法检测BALF中IL-5、IL-13和γ干扰素(IFN-γ)的含量及血清中特异性Ig E和Ig G2a水平。结果除PBS组小鼠外,其他组小鼠自第21天开始出现不同程度的哮喘症状。自第25天开始,免疫治疗组小鼠的哮喘症状开始缓解。哮喘组和PBS组小鼠BALF中嗜酸粒细胞总数分别为(4.41±0.36)×10~5/ml和(0.37±0.08)×10~5/ml,两组差异有统计学意义(t=24.50,P<0.01);免疫治疗组和抑制剂组小鼠的嗜酸粒细胞总数分别为(1.43±0.14)×10~5/ml和(2.73±0.33)×10~5/ml,均明显低于哮喘组(F=129.72,P<0.01)。ELISA检测结果显示,哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组BALF中IFN-γ的水平分别为(83.06±11.38)、(277.97±22.46)、(175.13±13.41)和(224.77±19.97)pg/ml,免疫治疗组和抑制剂组均明显高于哮喘组(t=17.31,t=11.71,P<0.01)。哮喘组、免疫治疗组、抑制剂组和PBS组小鼠BALF中IL-5水平分别为(208.64±11.55)、(106.87±11.39)、(140.71±14.58)和(90.15±9.49)pg/ml,哮喘组的水平明显高于其他各组(F=97.19,P<0.01)。哮喘组和免疫治疗组BALF中IL-13水�
文摘目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+),将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET-28a(+)-Der f 1,Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个。屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近。推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%。结论尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。
文摘目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。
文摘目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH5α,筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆,培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析;应用Lipo-fectamine 2000脂质体转染剂,重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法,以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Der p 1基因与Genbank上Der p 1cDNA全长序列完全一致,且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致;成功构建含Der p 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1,其能在真核细胞成功表达重组蛋白。
文摘目的 建立一种能快速、准确检测环境中屋尘螨过敏原Der p 1基因的逆转录环介导等温扩增可视化(RT-LAMP)技术。方法 用Primer Explore 4.0对Der p 1基因进行RT-LAMP引物设计与筛选,提取屋尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨总RNA,利用优化的RT-LAMP反应体系分别扩增4个螨种的Der p 1基因,评价方法的特异度和灵敏度。采集74份哮喘患儿的床尘样品,提取总RNA进行Der p 1基因RT-PCR和RT-LAMP检测。结果 利用优化的RT-LAMP方法检测4种螨的Der p 1基因,只有屋尘螨阳性,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物呈现特征性梯形条带,肉眼和紫外灯下均观察到绿色荧光。建立的RT-LAMP对Der p 1基因的最小检测量为1.0×10^(-6 )μg,敏感性比常规RT-PCR高10倍;检测74份床尘样品,阳性率85.1%,与RT-PCR阳性率70.3%比较差异具有统计学意义(χ^(2)=4.72,P<0.05)。结论 建立的屋尘螨过敏原Der p 1基因RT-LAMP较常规RT-PCR灵敏度和特异性更高,可用于屋尘螨过敏原污染的快速检测。
