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大肠杆菌LTB与霍乱弧菌CTB基因的克隆和表达及鉴定 被引量：9
1
作者 夏肖萍 严杰 +2 位作者 钊守凤 毛亚飞 李淑萍 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2003年第1期17-20,共4页
目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列... 目的 :克隆大肠杆菌不耐热肠毒素 B亚单位 (L TB)及霍乱弧菌肠毒素 B亚单位 (CTB)基因 ,构建其表达载体。方法 :采用高保真 PCR分别从 E.coli4 4 815株与 V.cholerae东 74株基因组 DNA中扩增 L TB与 CTB基因 ,T- A克隆后测定核苷酸序列。分别构建 p ET32 a的 LTB及 CTB表达载体 ,在 E.coli BL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的 IPTG诱导表达。采用 SDS- PAGE及 GM1- EL ISA鉴定表达产物。结果 :所克隆的 LTB和 CTB基因与报道的相应核苷酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 98.5 4 %～ 99.4 2 % ,氨基酸序列同源性分别高达 97.5 8%～99.19%和 96.77%～ 99.19%。p ET32 a- L TB- BL2 1DE3和 p ET32 a- CTB- BL2 1DE3系统表达的融合蛋白产量分别占细菌总蛋白的 30 %和 10 %左右。GM1- EL ISA结果证实 LTB及 CTB融合蛋白均能与牛 GM1结合。结论 :本研究成功地构建了 LTB与 CTB表达系统 ,所表达的 L TB与 CTB融合蛋白具有粘膜免疫佐剂活性。 展开更多
关键词 大肠杆菌 LTB基因 霍乱弧菌 ctb基因 分子克隆 LTB融合蛋白 ctb融合蛋白 免疫学
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rLTB/rCTB-rOmpL1/1融合基因及其原核表达系统的构建和鉴定 被引量：7
2
作者 阮萍 严杰 +3 位作者 毛亚飞 李淑萍 罗依惠 李立伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2005年第1期21-26,共6页
目的 :构建 lt B/ ct B- omp L1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性 ,检测问号钩端螺旋体 (简称钩体 )野生株 omp L 1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lt B- om... 目的 :构建 lt B/ ct B- omp L1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫和佐剂活性 ,检测问号钩端螺旋体 (简称钩体 )野生株 omp L 1基因的携带和表达情况及钩体患者血清特异性抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lt B- omp L 1/ 1和 ct B- omp L 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE、Westernblot和 GM1- ELISA分别检测目的重组蛋白 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L 1/ 1表达量、免疫反应性及与 GM1结合的活性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 omp L1基因及其表达情况。采用 ELISA检测 2 2 8例钩体患者血清 omp L1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lt B- omp L1/ 1和 ct B- omp L1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性 ,分别为 99.7%～ 99.9%和 99.5 %～ 10 0 %。r LTB- r Omp L1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1表达产量均约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。 r LTB- r Omp L 1/ 1和 r CTB- r Omp L1/ 1均分别能与r Omp L 1/ 1兔抗血清和牛 GM1结合。 89.7%问号钩体野生株含有 omp L1基因 ,87.6 %问号钩体野生株分别与r Omp L 1/ 1和 r Omp L1/ 2兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 2 5 6的 MAT阳性结果。 86 .8%和 88.6 %的患? 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 ompL1基因 大肠埃希茵 LTB基因 霍乱弧茵 ctb基因 序列同源性 核酸 序列同源性 氨基酸 克隆 分子 rLTB—rOmpLl/1/免疫学 rctb-rOmpL1/1/免疫学
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问号钩端螺旋体rLTB/rCTB-LipL32/1免疫保护作用及野生株LipL32基因表达和患者抗体检测 被引量：4
3
作者 阮萍 严杰 +1 位作者 毛亚飞 周晓辉 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期369-374,共6页
目的　构建LTB- LipL32/ 1和CTB- LipL32 / 1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法　采用常规... 目的　构建LTB- LipL32/ 1和CTB- LipL32 / 1融合基因原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫和佐剂活性及保护作用,了解问号钩端螺旋体(简称钩体)野生株LipL32基因携带、表达及钩体病人血清LipL32基因产物抗体产生频率。方法　采用常规分子生物学技术构建LTB- LipL32 / 1和CTB- LipL32 /1融合基因及其原核表达系统。采用SDS PAGE检测目的重组蛋白rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 / 1表达情况。分别采用Westernblot和GM1 -ELISA检测rLTB -LipL32 / 1及rCTB -LipL32 /1的免疫反应性和佐剂活性。采用PCR和MAT分别检测97株问号钩体野生株LipL32基因及其表达情况。采用ELISA检测2 2 8例钩体病人血清LipL32基因产物的抗体。采用豚鼠保护试验检测重组蛋白的免疫保护作用。结果　与报道的相关序列比较,LTB -LipL32 /1和CTB- LipL32 / 1融合基因核苷酸序列相似性分别为99.12 %～99.71%和98.5 4 %～99.4 2 % ,氨基酸序列相似性分别为97.5 8%～99.6 3%和96 .77%～99.6 3%。rLTB- LipL32 1和rCTB- LipL32 /1表达产量均约为细菌总蛋白的10 % ,并主要以包涵体形式存在。rLTB -LipL32 / 1和rCTB- LipL32 /1均分别能与LipL32 /1兔抗血清和牛GM1结合。97.9%(95 97)问号钩体野生株含有LipL32基因,95 .9% (93 97)问? 展开更多
关键词 问号钩端螺旋体 lipL32基因 大肠埃希菌 LTB基因 霍乱弧菌 ctb基因 免疫性佐剂活性
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含幽门螺杆菌CagA、UreB蛋白与霍乱肠毒素B亚单位(CTB)融合基因的植物表达载体的构建及遗传转化 被引量：4
4
作者 程畅 陈珍 朱诚 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期29-33,共5页
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便... 幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤的发生也密切相关。目前所用的疫苗制造成本高、运输费用贵,然而利用转基因植物生产的植物疫苗成本低廉、服用方便是现有疫苗的良好替代品。将Hp相关蛋白与免疫佐剂CTB的融合基因(ctb-linker-cagA和ctb-linker-ureB)利用PCR、酶切、连接等一系列方法从载体p1300-WxCLCN和p1300-WxCLUN中重组到载体pCAMBIA2301中(含35S启动子),重组载体分别命名为p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN。通过冻融法将载体导入农杆菌EHA105菌株中,以农杆菌介导的方法,将重组载体p2301-35SCLCN和p2301-35SCLUN转化烟草黄苗榆和心叶烟,获得了具有卡那霉素抗性再生植株,经过酶切、PCR、GUS染色和PCR-Southern鉴定结果表明,目的基因分别正确插入载体中并稳定整合到植株中,为利用植物反应器生产幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 CAGA基因 ureB基因 ctb基因 基因融合 表达载体
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幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建 被引量：5
5
作者 姜云水 方平楚 +1 位作者 付亚萍 朱诚 《科技通报》 北大核心 2004年第3期189-193,共5页
目的　构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法　采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和... 目的　构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法　采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果　PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论　成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础. 展开更多
关键词 生物工程 幽门螺杆菌 CAGA基因 ctb基因 水稻Wx启动子 基因融合 植物表达载体
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免疫佐剂分子CTB基因的克隆与表达 被引量：1
6
作者 王涛 陈建平 +2 位作者 张雷 王玉芳 马莹 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 2004年第2期255-258,共4页
我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、We... 我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们成功地扩增出 376 bp的霍乱弧菌 B亚基基因 ;构建免疫佐剂分子的重组质粒 p CTB;并在原核系统中表达出 12 KD的霍乱弧菌 B亚基抗原区带。 展开更多
关键词 免疫佐剂 ctb基因 克隆技术 基因表达 聚合酶链式反应
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霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达及重组蛋白活性分析 被引量：1
7
作者 张国广 曾雅明 +2 位作者 李东霄 张红心 陈亮 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期13-17,共5页
霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。根据已发表CTB基因的序列设计一对引物，从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因，测序后发现该基因全长375bp，与国内分离的六株CTB基因的同源性达96．0％-99．2％。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体p... 霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。根据已发表CTB基因的序列设计一对引物，从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因，测序后发现该基因全长375bp，与国内分离的六株CTB基因的同源性达96．0％-99．2％。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体pTWIN1-CTB，重组表达载体转化BL21（DE3）表达菌株，0．8mmol／LIPTG诱导4h后，收获的细菌总蛋白SDS—PAGE电泳显示CTB在原核表达系统中得到表达，融合蛋白大小与理论值符合，蛋白产量占细菌总蛋白的20％左右，主要以包涵体形式存在，Western杂交和GM1-ELISA结果表明重组蛋白具有免疫原性和粘膜佐剂活性。 展开更多
关键词 霍乱弧菌ctb基因 原核表达 粘膜佐剂活性
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水稻耐寒基因CTB4a的核苷酸多样性及区域适应性
8
作者 宋佳 职铭阳 +6 位作者 陈强 李玥莹 吴隆坤 农保选 李丹婷 逄洪波 郑晓明 《生物多样性》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期60-68,共9页
为探究CTB4a基因的自然变异是否与栽培稻苗期耐低温相关,本研究以133份栽培稻(Oryza sativa L.)及35份普通野生稻(O.rufipogon Griff.)为实验材料,对CTB4a编码区的核苷酸多样性及其单倍型与地理分布的关系进行分析。结果表明CTB4a基因... 为探究CTB4a基因的自然变异是否与栽培稻苗期耐低温相关,本研究以133份栽培稻(Oryza sativa L.)及35份普通野生稻(O.rufipogon Griff.)为实验材料,对CTB4a编码区的核苷酸多样性及其单倍型与地理分布的关系进行分析。结果表明CTB4a基因编码区有14个核苷酸变异,组成33个单倍型。Network分析发现,这些单倍型的286 bp处的SNP变异(+2,035,097 bp,G>C;+96 aa,Ala→Pro)将其分成Group A和Group B两组。Group A(CTB4a^(jap))共有56份样品,其中有43份(76.79%)是种植于中高纬度地区的粳稻;Group B(CTB4a^(ind))有77份样品,有63份(83.12%)是种植于热带和亚热带国家的籼稻。Group A中样品苗期黄叶率的平均值比Group B样品低30%,且两者耐寒性具有显著差异(P=1.25e-09)。位于286 bp处的变异只在Group A中出现,在Group B中均不存在,说明随着水稻种植区域向北迁移的育种过程中,栽培稻中出现了CTB4a^(jap)并被固定下来。该研究为理解水稻对低温适应的分子遗传机制和培育耐寒品种提供了理论基础。 展开更多
关键词 栽培稻 ctb4a基因 核苷酸多样性 单倍型 适应性
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