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高致病性猪链球菌2型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：9
1
作者 朱静 张锦海 +5 位作者 胡丹 石洁 张先云 李先富 潘秀珍 王长军 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2012年第5期325-328,共4页
目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪... 目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估。结果反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60min内完成。SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19cfu/ml、27cfu/ml和32cfu/ml。重复性试验中变异系数均小于3%。用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强。对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性。结论建立的多重实时荧光定量PCR方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 多重实时荧光定量PCR SalK基因 virB4-89K基因 cps2j基因
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猪链球菌2型荚膜多糖cps2J基因的克隆与原核表达 被引量：3
2
作者 刘燕 刘军 +3 位作者 冯书章 郭学军 孙洋 祝令伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期434-437,共4页
利用PCR方法从猪链球菌2型(SS2)四川资阳分离株449-1扩增出cps2J基因,克隆到pMD18-T载体,经酶切与表达质粒pMAL-p2x构建重组表达质粒pMALp2x-cps2J,转化至宿主菌TB1中诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了约80ku的可溶... 利用PCR方法从猪链球菌2型(SS2)四川资阳分离株449-1扩增出cps2J基因,克隆到pMD18-T载体,经酶切与表达质粒pMAL-p2x构建重组表达质粒pMALp2x-cps2J,转化至宿主菌TB1中诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了约80ku的可溶性目的蛋白MBP-cps2J,约占菌体蛋白总量的13.5%。表达蛋白用Amylose树脂层析柱纯化,将纯化的融合蛋白MBP-cps2J免疫家兔制备抗血清,经ELISA和协同凝集试验检测,其与SS2呈特异性阳性反应。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 cps2j基因 协同凝集试验
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琼脂糖凝胶电泳与核酸印迹杂交法检测细菌毒力基因PCR产物的灵敏度比较研究 被引量：3
3
作者 綦廷娜 刘志广 +2 位作者 王涛 李培京 叶长芸 《疾病监测》 CAS 2011年第8期651-653,共3页
目的探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值。方法分别以10倍连续稀释的O157∶H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(P... 目的探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值。方法分别以10倍连续稀释的O157∶H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)。用1%琼脂糖凝胶电泳及核酸印迹杂交法检测PCR产物,比较两种方法的最低检测限。结果 1%琼脂糖凝胶电泳对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×102cfu(56.87 pg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×102 cfu(12.65 pg)/PCR体系;核酸印迹杂交法对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×10-1 cfu(56.87 fg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×10-1 cfu(12.65 fg)/PCR体系。结论用核酸印迹杂交法检测肠出血性大肠埃希菌stx2基因和猪链球菌cps2J基因PCR产物的灵敏度均比普通琼脂糖凝胶电泳检测法高了1000倍。 展开更多
关键词 核酸印迹杂交 琼脂糖凝胶电泳 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 猪链球菌2型 stx2基因 cps2j基因 检测灵敏度
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环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条检测猪链球菌2型的应用研究 被引量：3
4
作者 张莉 王利丽 +4 位作者 魏财文 杨春蕾 路超 池晶晶 鄢明华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1077-1082,1090,共7页
目的建立一种猪链球菌2型的快速检测方法。方法以猪链球菌2型cps2J基因序列为检测靶标设计6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,其中2条促环引物分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和地高辛(Dig),用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立猪链... 目的建立一种猪链球菌2型的快速检测方法。方法以猪链球菌2型cps2J基因序列为检测靶标设计6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,其中2条促环引物分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和地高辛(Dig),用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立猪链球菌2型LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测出猪链球菌2型,与试验对照菌株不存在交叉反应,其最低检测限为76cfu/mL,在对100份样品的检测中,LAMP-LFD方法检测出14份阳性样品,培养法检测出12份阳性样品,LAMP-LFD方法检测阳性率略高于病原培养法,两者间的P>0.05无统计学差异。结论所建立LAMP-LFD检测方法具有特异性好、敏感性高、操作简单、快速等特点,适合于动物食品中猪链球菌2型的检测。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 cps2j基因 环介导等温扩增 横向流动试纸条
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浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析 被引量：3
5
作者 姚苹苹 王复甦 +5 位作者 朱函坪 梅玲玲 叶菊连 罗进 张政 姚晨辉 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期62-64,共3页
目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载... 目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后采用ABI自动测序仪测定序列,并同国内外其他分离株的基因进行比较。结果扩增出9株菌株的Cps2J基因的完整开放阅读框(ORF)都为999bp,编码333个氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;与国内外其他的SS2核苷酸的同源性为98.8%～99.0%,与猪链球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。结论9株浙江省猪链球菌2型分离株Cps2J基因序列非常保守,这些不同来源的菌株可能有相同的起源。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 cps2j基因 序列分析
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3株人源猪链球菌2型湖南株cps2J、gdh、ef基因进化分析 被引量：1
6
作者 欧新华 张如胜 +5 位作者 苏良 杨柳青 肖姗 姚栋 宋克云 孙边成 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期369-374,共6页
目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对... 目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行分析。结果 cps2J、gdh、ef基因包含的完整开放阅读框(ORF)分别为999bp、1 347bp、2 532bp,分别编码333、448、843个氨基酸。在线BLAST同源性分析表明,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株属于S.suis 2,3菌株cps2J、gdh、ef基因组序列之间的核苷酸同源性均为100%;进化树显示,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株与国内外猪源和人源S.suis 2菌株属于同一分支,同源性比较显示3株S.suis 2湖南分离株cps2J、gdh、ef基因与其他国内外S.suis株核苷酸序列同源性分别为99.8%～100%、96.4%～100%和99.7%～100%,氨基酸同源性分别为98.5%～100%、98.7%～100%和99.5%～100%。结论 3株人源S.suis 2湖南株cps2J、gdh、ef基因序列与国内外S.suis 2菌株相应基因序列同源性高,变异程度小。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 cps2j基因 gdh基因 ef基因 进化分析
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猪链球菌2型浙江嘉兴株毒力基因序列分析 被引量：1
7
作者 高雯洁 姚苹苹 +3 位作者 朱函坪 王恒辉 陈黎霞 梅玲玲 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期762-763,共2页
目的猪链球菌2型(SS2)浙江嘉兴ZJJX2008分离株毒力基因序列测定与分析。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J和EF基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并与国内外其他分离株基因进行比较。结果 Cps2J、EF基因完... 目的猪链球菌2型(SS2)浙江嘉兴ZJJX2008分离株毒力基因序列测定与分析。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J和EF基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并与国内外其他分离株基因进行比较。结果 Cps2J、EF基因完整开放阅读框(ORF)分别为999,2532bp,各自编码333,843个氨基酸,ZJJX2008分离株Cps2J、EF基因与国内外SS2菌株核苷酸同源性分别为99.1%～100%和99.8%～99.9%,氨基酸同源性分别为99.2%～99.7%和99.3%～99.5%;ZJJX2008分离株Cps2J基因与猪链球菌1型荷兰分离株6555核苷酸和氨基酸同源性只有66.7%和51.8%。结论 ZJJX2008分离株为猪链球菌2型菌株,Cps2J、EF基因与国内外其他SS2分离株比较序列非常保守,变异不大。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 cps2j基因 EF基因 序列分析
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猪源2型链球菌福建株cps2j基因PCR检测及序列分析 被引量：1
8
作者 俞伏松 郭长明 +2 位作者 车勇良 林天龙 陈少莺 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第17期10-14,共5页
设计并合成一对扩增2型猪链球菌cps基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株(SS2PFJ07)DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测cps2j基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下:应用该方法对猪2型链球菌福建株... 设计并合成一对扩增2型猪链球菌cps基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株(SS2PFJ07)DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测cps2j基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下:应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg细菌DNA;SS2PFJ07cps2j基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%～100%和97.8%～100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌cps2j基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测;序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 福建株 cps2j基因 PCR
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2型猪链球菌河南株cps2J基因的遗传进化关系分析 被引量：2
9
作者 张青娴 徐引弟 +3 位作者 王治方 朱文豪 许峰 王克领 《养猪》 2020年第2期121-123,共3页
从河南某猪场断奶仔猪发生疫情的病死猪脑脊液中分离到一株细菌,经革兰氏染色初步确定为猪链球菌,应用PCR方法扩增猪链球菌谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)和荚膜多糖基因(capsular polysaccharide,cps)进行猪链球菌及血清... 从河南某猪场断奶仔猪发生疫情的病死猪脑脊液中分离到一株细菌,经革兰氏染色初步确定为猪链球菌,应用PCR方法扩增猪链球菌谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)和荚膜多糖基因(capsular polysaccharide,cps)进行猪链球菌及血清型鉴定,将阳性产物测序,并进行序列比较分析。结果表明,该分离株为2型猪链球菌,与参考菌株同源性在98%以上,其cps2J基因与人源致病性猪链球菌同源性达99.6%。 展开更多
关键词 2型猪链球菌 cps2j基因 遗传进化
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猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化
10
作者 方勤美 朱继昌 +1 位作者 池洪树 林天龙 《福建农业学报》 CAS 2012年第12期1275-1279,共5页
根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·... 根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。 展开更多
关键词 猪链球菌2型、PCR-ELISA cps2j基因
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