前沿生物医学电子显微技术的发展态势与战略分析 被引量：4

1

作者 陶长路 张兴 +3 位作者 韩华 梁文锡 赵经纬 毕国强 《中国科学：生命科学》 CSCD 北大核心 2020年第11期1176-1191,共16页

电子显微成像技术(简称电镜)因其超高分辨能力,成为人类认识微观世界的最主要技术手段之一,并广泛应用于生物医学研究领域.随着物理、生物、信息等多学科技术的发展和融合,电子显微镜在分辨率、成像尺度和自动化等多个方面不断取得突破... 电子显微成像技术(简称电镜)因其超高分辨能力,成为人类认识微观世界的最主要技术手段之一,并广泛应用于生物医学研究领域.随着物理、生物、信息等多学科技术的发展和融合,电子显微镜在分辨率、成像尺度和自动化等多个方面不断取得突破,特别是冷冻制样技术和直接电子探测相机的发展使得冷冻电镜技术能够直接解析生物大分子的原子分辨率三维结构.另一方面,对生命活动过程的研究往往跨越多个时空尺度,甚至需要追踪生物事件发生的动态过程,这就要求研究手段在分辨率、原位成像、动态、多尺度、多模态、高特异性和高通量等特性上不断拓展.针对这些需求,生物医学电镜及相关技术的主要发展方向包括:(ⅰ)高分辨冷冻电镜技术,通过更精确的三维重构理论和电子光学成像技术进一步提高信噪比和分辨率,实现对更大、更小生物分子的原子分辨率结构解析;(ⅱ)基于冷冻电子断层三维重构的多模态成像技术,通过更优化的冷冻制样减薄技术、亚区域三维重建技术等,实现对组织与细胞中蛋白质等大分子复合物的结构与相互作用的原位解析,并通过与光学成像的动态性与特异性的有效整合,实现结构与功能研究的结合;(ⅲ)大尺度三维重建的体电子显微成像技术,通过优化样品制备、成像及分析,实现整个流程的高通量系统集成,从而进行脑联结组等生物结构的图谱重建;(ⅳ)具有飞秒量级时间分辨的超快电镜技术,通过进一步发展脉冲电子源、液相样品室等,将为蛋白质分子异构、生物组织与纳米材料的物理化学相互作用等动态过程研究提供新的观测工具;(ⅴ)大数据存储和处理技术与基于人工智能的图像处理方法,将进一步推动海量电镜数据的快速、高效、自动化的处理与分析.本文重点评述了以上技术方向的发展趋势、所面临的瓶颈问题以及 展开更多

关键词 电子显微成像技术 冷冻电镜技术 冷冻电子断层三维重建技术 光电关联显微成像技术 体电子显微成像技术 超快电镜技术 大数据与人工智能

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光电关联显微镜技术快速定位样品台的设计及应用

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作者 戴玉洁 常林 赵复庆 《分析测试技术与仪器》 CAS 2024年第1期16-22,共7页

光电关联显微镜技术结合了光学显微镜与电子显微分析技术,可获得样品同一位置的光学图像和高分辨电子图像,以实现更全面准确的样品表征,因而被广泛应用于材料科学、光学工程等学科.相较于传统非联用技术,光电关联显微镜技术可快速获取... 光电关联显微镜技术结合了光学显微镜与电子显微分析技术,可获得样品同一位置的光学图像和高分辨电子图像,以实现更全面准确的样品表征,因而被广泛应用于材料科学、光学工程等学科.相较于传统非联用技术,光电关联显微镜技术可快速获取同一区域样品对应的光学图像、电子图像以及光谱信息等样品特征.为此,通过微纳加工技术制备了带有快速定位功能的光电关联显微镜样品台,结合能谱定位系统实现特定区域样品快速定位、跨尺度多维度表征,对相关科研工作具有重要意义. 展开更多

关键词 光电关联显微镜技术 样品台 拉曼光谱 原子力显微镜

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一种用于贴壁培养细胞感染病毒检测的简易光镜-电镜联用技术 被引量：1

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作者 冯红丽 彭宇宁 宋敬东 《电子显微学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期86-93,共8页

目的:建立一种简单易行的适用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。方法:使用Lab-Tek腔室玻片培养细胞并接种不同类型病毒,通过光学显微镜选取目标病变细胞或通过荧光蛋白、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记、量子点标记确定目标细胞并在腔... 目的:建立一种简单易行的适用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。方法:使用Lab-Tek腔室玻片培养细胞并接种不同类型病毒,通过光学显微镜选取目标病变细胞或通过荧光蛋白、免疫细胞化学标记、免疫荧光标记、量子点标记确定目标细胞并在腔室玻片上标记其部位。随后将腔室玻片改造为包埋模具,最后钻取目标细胞及其包埋树脂,并对目标细胞进行靶向性超薄切片及透射电子显微镜观察。结果:光镜下选取的目标细胞在透射电子显微镜下可顺利定位并进行观察。结论:建立了一种基于腔室玻片包埋模具的可用于病毒检测的光镜-电镜联用技术。 展开更多

关键词 透射电子显微镜 光镜-电镜联用技术 病毒 检测

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荧光导航冷冻聚焦离子束减薄技术的研究进展

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作者 李尉兴 卢婧 +1 位作者 肖珂 纪伟 《中国激光》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第21期28-41,共14页

细胞超微结构的原位解析是当前的一个研究热点。冷冻电子断层扫描成像技术(cryo-ET)是目前细胞原位结构解析的核心技术。cryo-ET只能对厚度小于300 nm的样品进行成像,因此利用cryo-ET研究细胞超微结构时首先需要对细胞进行减薄。聚焦离... 细胞超微结构的原位解析是当前的一个研究热点。冷冻电子断层扫描成像技术(cryo-ET)是目前细胞原位结构解析的核心技术。cryo-ET只能对厚度小于300 nm的样品进行成像,因此利用cryo-ET研究细胞超微结构时首先需要对细胞进行减薄。聚焦离子束(FIB)切割是目前冷冻生物样品减薄的主流技术。传统FIB切割只能在细胞的任意位置上进行“盲切”,无法对细胞内部特定研究目标进行定点切割。光电融合成像技术(CLEM)恰可解决这一问题。CLEM利用荧光成像技术识别并定位研究目标,通过光电图像的关联匹配,可在FIB图像中确定荧光目标的位置,进而指导FIB的定点减薄。针对荧光导航cryo-FIB减薄的相关技术方法、仪器设备和工作流程进行了梳理,分析对比了主流方案的优缺点,旨在帮助研究者选择出合适的荧光导航FIB减薄方案,并对该技术的未来发展方向进行了展望。 展开更多

关键词 生物医学 冷冻电子断层扫描成像技术 扫描电镜 荧光成像技术 快速冷冻 聚焦离子束减薄 光电融合成像技术

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一种简单的光-电关联方法 被引量：3

5

作者 胡西学 郭宏博 +3 位作者 宫宁强 敖卓 彭开武 甘雅玲 《电子显微学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期403-407,共5页

光-电关联显微镜检测是研究荧光材料与生物样品相互作用的有力手段之一.然而,常规电镜样品制备过程中使用的锇酸会引起荧光淬灭,导致光-电关联显微镜观察的失败.本文摸索了一种在室温下进行原位光-电关联显微镜观察的简单方法,避免了样... 光-电关联显微镜检测是研究荧光材料与生物样品相互作用的有力手段之一.然而,常规电镜样品制备过程中使用的锇酸会引起荧光淬灭,导致光-电关联显微镜观察的失败.本文摸索了一种在室温下进行原位光-电关联显微镜观察的简单方法,避免了样品的冷冻切片与观察.该方法在室温下即可对同一位置、同一细胞和同一细胞器的结构和荧光信号进行观察,通过软件处理,很容易将电镜和光镜图像进行叠加运算获得光-电关联显微镜结果,从而实现了光镜和电镜在室温下的关联检测方法. 展开更多

关键词 光-电关联显微术

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建立基于miniSOG标签的光镜-电镜关联方法观察腺病毒Ⅸ蛋白的亚细胞定位 被引量：2

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作者 邹小辉 邵博 +3 位作者 王敏 屈建国 鲁茁壮 洪涛 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期8-12,共5页

目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白Ⅸ的细胞内定位.方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白Ⅸ与miniSOG的融合基因ⅨSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;通过荧光... 目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白Ⅸ的细胞内定位.方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白Ⅸ与miniSOG的融合基因ⅨSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;通过荧光显微镜确定ⅨSOG蛋白表达的细胞,之后对转染细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内ⅨSOG融合蛋白的表达及分布情况.结果 在蓝光激发下,miniSOG能够发射绿色荧光.定位选择光氧化形成嗜锇颗粒的ⅨSOG表达细胞进行电镜观察,结果显示Ⅸ蛋白在细胞核内多个区域形成点状聚集或包涵体.结论 建立了依赖miniSOG标签的的光镜-电镜关联方法,该方法可用于病毒蛋白细胞内定位研究. 展开更多

关键词 MiniSOG Ⅸ蛋白 光氧化 光镜.电镜关联技术

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冷冻超分辨光电融合成像技术——新挑战,新机遇 被引量：1

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作者 李尉兴 谷陆生 +3 位作者 徐晓君 薛艳红 纪伟 徐涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2018年第9期957-960,共4页

冷冻超分辨光电融合成像技术近年来发展迅速,该技术结合了荧光显微镜特异性标记与冷冻电镜超高分辨率的优势,成为细胞原位结构研究的新手段,有望发展成为下一代成像技术.本文从发展背景、应用领域等几个方面,介绍了冷冻超分辨光电融合... 冷冻超分辨光电融合成像技术近年来发展迅速,该技术结合了荧光显微镜特异性标记与冷冻电镜超高分辨率的优势,成为细胞原位结构研究的新手段,有望发展成为下一代成像技术.本文从发展背景、应用领域等几个方面,介绍了冷冻超分辨光电融合成像技术的概况及未来发展前景. 展开更多

关键词 超分辨成像 冷冻电镜 光电融合 原位

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透射电镜和光镜联合应用于细胞观察 被引量：1

8

作者 李红梅 张勤奋 +3 位作者 李茵茵 张楚英 张子健 张以顺 《实验室研究与探索》 CAS 北大核心 2019年第11期18-20,65,共4页

在光学显微镜下获得细胞的全视野荧光图像及位置信息,并在培养皿进行原位细胞透射电镜样品制备、超薄切片及染色,最后在透射电镜下获得目标细胞的超微结构信息。采用该方法成功获得处于细胞分裂M期细胞的显微结构,既有完整细胞的荧光图... 在光学显微镜下获得细胞的全视野荧光图像及位置信息,并在培养皿进行原位细胞透射电镜样品制备、超薄切片及染色,最后在透射电镜下获得目标细胞的超微结构信息。采用该方法成功获得处于细胞分裂M期细胞的显微结构,既有完整细胞的荧光图像,又有局部的超微结构的高分辨图像。该方法能够用在较高分辨率下分析亚细胞结构分布以及特定结构的动态变化。 展开更多

关键词 透射电镜 光学显微镜 光电联用

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利用光镜-电镜关联方法研究发热伴血小板减少综合征病毒核蛋白的亚细胞定位 被引量：1

9

作者 牛国宇 张尊 +6 位作者 夏百成 刘淑慧 高旭 芜为 邹小辉 鲁茁壮 洪涛 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2018年第1期75-79,共5页

目的 通过miniSOG蛋白标记技术观察发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）核蛋白NP在不同时相下的细胞内定位及特点.方法 miniSOG是新发现的能够被电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆SFTSV核蛋白NP与miniSOG融合基因NPSOG,将其构... 目的 通过miniSOG蛋白标记技术观察发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）核蛋白NP在不同时相下的细胞内定位及特点.方法 miniSOG是新发现的能够被电子显微镜解析的蛋白标签.通过PCR方法克隆SFTSV核蛋白NP与miniSOG融合基因NPSOG,将其构建至真核表达载体,转染细胞;之后对不同转染时相的细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片,用电镜观察细胞内NPSOG蛋白的表达及分布特点.结果 携带NPSOG基因的质粒转染细胞后,核蛋白NP在胞浆及核周表达,并逐渐聚集,连接内质网、高尔基体等细胞器在胞浆中形成体积较大、形状不规则的包涵体样结构,未见其他亚细胞结构改变.结论 SFTSV核蛋白NP单独表达即可形成包涵体,无需其他病毒蛋白协助;包涵体的形成需要一定数量蛋白的定向移动并聚集,这期间可能涉及蛋白与宿主细胞器的相互作用. 展开更多

关键词 MiniSOG SFTSV 核蛋白 光镜.电镜关联技术

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冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像技术研究进展 被引量：2

10

作者 贾星 孙飞 季刚 《植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期24-29,共6页

冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像(Cryo-FIB-SEM)是一种新兴的成像检测技术,在原位进行冷冻聚焦离子束切割和冷冻扫描电镜成像,为研究天然含水状态下生物样品内部未被破坏的原始结构打开了一扇窗口。近年来,该技术在生命科学领域的应用研究... 冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像(Cryo-FIB-SEM)是一种新兴的成像检测技术,在原位进行冷冻聚焦离子束切割和冷冻扫描电镜成像,为研究天然含水状态下生物样品内部未被破坏的原始结构打开了一扇窗口。近年来,该技术在生命科学领域的应用研究取得了一系列重要进展。该文对其在冷冻体积连续成像、冷冻光电关联成像、冷冻透射扫描成像、冷冻含水切片制备监控及冷冻扫描图像处理等方面的研究进展进行综述,并展望了该技术在大体积生物样品三维原位成像研究领域的前沿性发展趋势,以期推动Cryo-FIB-SEM技术在生物样品三维结构研究中的应用。 展开更多

关键词 冷冻聚焦离子束-扫描电镜成像 冷冻光电关联 冷冻体积连续成像 冷冻透射扫描成像

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原位冷冻光电关联技术的研究进展

11

作者 卢婧 李尉兴 +1 位作者 徐晓君 纪伟 《中国光学（中英文）》 EI CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1275-1286,共12页

冷冻电子断层扫描成像(cryo-ET)是细胞原位解析生物大分子结构的核心技术,cryo-ET的样品厚度需要小于300 nm,冷冻样品聚焦离子束减薄(FIB)是样品制备流程中的必要环节。当前,FIB存在难以迅速精确定位目标区域的问题,原位冷冻光电关联技... 冷冻电子断层扫描成像(cryo-ET)是细胞原位解析生物大分子结构的核心技术,cryo-ET的样品厚度需要小于300 nm,冷冻样品聚焦离子束减薄(FIB)是样品制备流程中的必要环节。当前,FIB存在难以迅速精确定位目标区域的问题,原位冷冻光电关联技术(cryo-CLEM)是一项新兴的技术,对原位冷冻样品分别进行冷冻光镜成像和电镜成像,结合了荧光成像的定位优势和电镜成像的分辨率优势,通过将光镜和电镜图像进行配准,指导FIB对原位冷冻样品减薄,能够极大地提高cryo-ET的样品制备效率。本文介绍了cryo-CLEM中的原位冷冻技术和光电关联成像技术的最新进展和应用情况,重点讨论了超分辨cryo-CLEM成像技术以及嵌入式cryo-CLEM技术,分析了各种方法的优缺点和适用范围,并对cryo-CLEM技术当前面临的主要限制和未来的发展方向进行了展望。 展开更多

关键词 光电关联成像 荧光导航聚焦离子束减薄 光学超分辨

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MiniSOG蛋白的单克隆抗体制备及初步研究

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作者 高利萍 武月章 +4 位作者 杨雪花 陈冬冬 肖康 董小平 石琦 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期880-887,共8页

单线态氧产生者(mini singlet oxygen generator,miniSOG)是改造于拟南芥向光素2蛋白而获得的小分子荧光黄素蛋白,由106个氨基酸残基组成。miniSOG被广泛用于电镜及荧光显微镜,并被广泛用于发色团辅助的光灭活(Chromophore-assisted lig... 单线态氧产生者(mini singlet oxygen generator,miniSOG)是改造于拟南芥向光素2蛋白而获得的小分子荧光黄素蛋白,由106个氨基酸残基组成。miniSOG被广泛用于电镜及荧光显微镜,并被广泛用于发色团辅助的光灭活(Chromophore-assisted light inactivation,CALI)蛋白、DNA或RNA,并结合免疫光敏用于癌症的治疗,以及结合细胞消融用于神经科学、免疫生物学等。但是目前国内并无商品化的miniSOG抗体,为了辅助课题研究,制备抗miniSOG蛋白的单克隆抗体,本研究根据miniSOG基因的ORF区序列构建miniSOG-GST重组蛋白的原核表达载体PGEX-4T-1-miniSOG,然后将该重组质粒转化于BL21感受态大肠杆菌中,异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-DThiogalactoside,IPTG)诱导融合蛋白的表达,并经亲和层析方法进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。筛选获得稳定分泌抗miniSOG的单克隆抗体细胞株,最终选取性能最优的4F9细胞株进行小鼠腹水制备并纯化。单抗4F9亚型为IgG1/Kappa,腹水滴度达到1∶200 000,纯化抗体灵敏度达到5 ng/mL。并通过Western Blot、免疫荧光及免疫组化方法进行特异性鉴定,该单克隆抗体能特异性识别转染细胞和转基因小鼠脑组织中的miniSOG蛋白。本研究在国内首次制备了miniSOG单克隆抗体,将丰富其在其它方面的应用。 展开更多

关键词 单线态氧产生者(miniSOG) 光电镜关联(CLEM) 单克隆抗体

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