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靶向cofilin2基因RNAi对鸭病毒性肠炎病毒增殖的影响 被引量：1
1
作者 王微 华敏 +5 位作者 张芸 李涛 张黔东 袁阳 程振涛 文明 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期983-989,共7页
旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响。本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察... 旨在探讨cofilin2基因的表达在鸭病毒性肠炎病毒(DEV)增殖过程中的影响。本研究通过已获得的鸭源cofilin2全基因序列(GenBank登录号:MF434775),设计出4对shRNA序列,插入载体中,并转染到鸭胚成纤维细胞中,经FQ-PCR方法和荧光显微镜观察筛选出具有较高干扰效率的shRNA序列,用干扰效率较高的shRNA序列转染到鸭胚成纤维细胞中抑制cofilin2基因的表达,再检测cofilin2在DEV复制过程中表达情况。结果显示:4对shRNA干扰质粒经转染至鸭胚成纤维细胞后,经荧光显微镜观察,构建的4对shRNA干扰质粒均成功转染并得到表达;4对干扰质粒沉默率分别为4.96%±0.78%、41.12%±2.94%、17.55%±2.07%、54.02%±1.73%,以cofilin2-86的沉默效率最高;cofilin2-86转染到鸭胚成纤维细胞,经DEV感染不同时间,其DEV核酸表达量明显下降。综上所述,靶向cofilin2基因RNA干扰在DEV复制和增殖过程发挥重要作用。 展开更多
关键词 鸭病毒性肠炎病毒 DEV RNA干扰 cofilin2
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小鼠cofilin2蛋白的原核表达及纯化
2
作者 袁白银 刘钟颖 《生物技术》 CAS 2019年第1期23-28,共6页
[目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)... [目的]构建小鼠cofilin2原核表达载体并纯化表达产物。[方法]以胚胎期小鼠心脏组织的c DNA为模板PCR扩增cofilin2基因,经酶切连接表达载体PGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E. coli BL21感受态细胞中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝R-250进行染色,检测GST-cofilin2的表达情况。通过谷胱甘肽树脂(Glutathione Resin)亲和层析进行纯化,最后通过Western Blot进行验证。[结果]PCR成功扩增cofilin2基因,双酶切及测序结果表明p GEX-4T-1-cofilin2原核表达载体构建成功,SDS-PAGE鉴定表明,在22℃、200μmol/L的IPTG能诱导出大量可溶性的GST-cofilin2蛋白,分子量为43 k Da。Western Blot验证得到纯化的GST-cofilin2。[结论]成功构建小鼠cofilin2原核表达载体,纯化得到的重组小鼠cofilin2蛋白可用于后续的生物学研究。 展开更多
关键词 cofilin2 原核表达 蛋白纯化 融合蛋白
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microRNA-671-5p在肝细胞癌中的表达及其负向调控丝切蛋白2与上皮细胞-间质转化的关系 被引量：1
3
作者 李亚昭 姚博文 石磊 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期43-52,共10页
背景与目的:近年研究发现,microRNA-671-5p(miR-671-5p)参与了多种恶性肿瘤的发生发展,同时与多种病毒介导的肝损伤相关,但其与肝细胞癌(HCC)之间的关系目前仍未见报道。本研究的目的为观察miR-671-5p在HCC中的表达情况,分析其功能及其... 背景与目的:近年研究发现,microRNA-671-5p(miR-671-5p)参与了多种恶性肿瘤的发生发展,同时与多种病毒介导的肝损伤相关,但其与肝细胞癌(HCC)之间的关系目前仍未见报道。本研究的目的为观察miR-671-5p在HCC中的表达情况,分析其功能及其与HCC生物学行为及临床病理特征的联系,并初步探讨作用机制。方法:用qRT-PCR检测80例HCC组织及癌旁组织样本、不同HCC细胞系(Hep3B、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721)及人正常肝细胞(L02)中miR-671-5p的表达,且在同时分析TCGA数据库中miR-671-5p在HCC组织与癌旁组织的表达差异。分析miR-671-5p表达量与临床病理因素的关系;用miR-671-5p抑制物敲低MHCC-97H细胞系中miR-671-5p的表后,分别采用CCK-8实验及Transwell实验分别检测HCC细胞转染miR-671-5p抑制物后增殖、侵袭及迁移能力的变化。利用TargetScan及Starbase网站预测miR-671-5p的靶基因,并通过Western blot、双荧光素酶实验及TCGA数据库分析验证。用Western blot观察降低miR-671-5p表达对HCC细胞中miR-671-5p靶基因及上皮细胞-间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)表达的影响,以及在此基础上同时敲低靶基因的表达后,以上蛋白表达的变化。结果:miR-671-5p的表达在HCC组织中明显高于其癌旁组织,在各种HCC细胞系中均明显高于正常肝细胞,且随着样本肿瘤分期与HCC细胞的侵袭力的增加而升高(均P<0.05);TCGA数据库分析也显示,miR-671-5p在HCC组织中的表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。miR-671-5p的表达水平与AFP水平、肿瘤数目、静脉侵犯、Edmondson-Steiner分级及TNM分期明显有关(均P<0.05)。转染miR-671-5p抑制物后,MHCC-97H细胞的增殖、侵袭及迁移能力均明显降低(均P<0.05)。生物信息学分析及双荧光素酶实验均显示丝切蛋白2(CFL2)是miR-671-5p潜在靶基因,TCGA数据库分析也显示miR-671-5p与CFL2的表达呈负相关(均P<0.05)。降低MHCC-97H细胞中miR-671-5p� 展开更多
关键词 癌 肝细胞 微RNA-671-5p 丝切蛋白2 上皮-间质转化
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三穗麻鸭Cofilin2基因序列分析及其组织表达研究
4
作者 华敏 贺欣薇 +3 位作者 万润 程振涛 周碧君 文明 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第4期858-865,共8页
为探究三穗麻鸭丝切蛋白2(Cofilin2)基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测... 为探究三穗麻鸭丝切蛋白2(Cofilin2)基因特征及其在鸭组织中的表达规律,试验根据GenBank中鸡Cofilin2基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增获得目的基因,利用生物信息学软件分析三穗麻鸭Cofilin2基因特征,实时荧光定量PCR方法检测Cofilin2基因在三穗麻鸭不同组织中的表达情况。结果显示,三穗麻鸭Cofilin2基因编码区大小为498bp,可编码166个氨基酸;三穗麻鸭Cofilin2基因序列与鸡、猕猴、牛、小鼠、安大略鲑、人和猪相应序列的同源性分别为94.4%、91.6%、91.6%、87.6%、77.7%、70.5%和69.5%;系统进化树显示,Cofilin2基因在不同物种进化过程中高度保守;Cofilin2基因编码蛋白的二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,三级结构呈弯曲螺旋结构;实时荧光定量PCR检测显示,三穗麻鸭Cofilin2基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、腿肌和法氏囊等组织器官中均有不同程度表达,其中心脏中表达量最高,法氏囊中表达量最低。本试验结果为三穗麻鸭抗病分子机理研究奠定了基础。 展开更多
关键词 三穗鸭 cofilin2基因 克隆 实时荧光定量PCR
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流体剪切促进人胚胎干细胞的启动
5
作者 武亿 吕东媛 +3 位作者 王家文 张帆 郑璐 龙勉 《医用生物力学》 EI CAS CSCD 北大核心 2019年第A01期145-145,共1页
目的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性,因此在组织器官移植、再生医学和药物研发等方面均具有重要作用。除生物化学因素对hESCs的调控外,生物力学因素也能通过调节力学敏感蛋白... 目的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性,因此在组织器官移植、再生医学和药物研发等方面均具有重要作用。除生物化学因素对hESCs的调控外,生物力学因素也能通过调节力学敏感蛋白、激活胞内信号通路、从而影响hESCs干性或分化等生物学特性。然而,流体剪切作用下hESCs的响应及其分子机制尚不十分清楚。方法基于平行平板流动腔装置对hESCs施加模拟生理参数的流体剪切力,研究其对细胞形态、凋亡、干性维持等的影响。基于前期力学组学的功能富集分析筛选特定力学敏感蛋白,并采用蛋白质免疫印迹等技术检测流体剪切作用下丝切蛋白2(Cofilin2)在胞质、胞核内的分布与总量变化,以及胞内总组蛋白(H2B)与乙酰化组蛋白(AcH2B)的变化特征。结果施加流体剪切后,细胞存活和干性维持能力与静止培养条件相比没有显著差异,形态学上细胞核铺展面积增加且集落背向来流方向的伪足收起;在分子层面,流体剪切作用下AcH2B与H2B的相对表达量均升高,全细胞及细胞质内Cofilin2的表达量升高,细胞核内Cofilin2的表达量不发生改变。结论流体剪切通过增加胞内骨架蛋白Cofilin2的表达增加细胞核的铺展面积,导致AcH2B表达增加,促使hESCs处于更易于接受诱导因子及转录因子而发生分化的启动状态。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 流体剪切 cofilin2 H2B AcH2B
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