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猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救 被引量：10
1
作者 邹兴启 赵启祖 +5 位作者 范运峰 朱元源 王琴 徐璐 范学政 宁宜宝 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期409-416,共8页
【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染... 【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 C株 感染性克隆构建 拯救方法 传代
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基于RAA-Cas13a的猪瘟病毒检测方法的建立
2
作者 薛俊欣 韩伟 +7 位作者 朱忠武 熊炜 黄忠荣 李春阳 赵新宇 孔祥翔 李健 蒋原 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第6期78-84,共7页
灵敏、准确、多样的检测方法对有效防控猪瘟疫情极其重要,为了丰富现有的猪瘟病毒(CSFV)检测技术,本研究拟建立基于RAA-Cas13a的检测方法。基于全序列比对的基础上分别设计1对引物和两条cr RNA,对不同浓度的阳性质粒、阳性样品和7种其... 灵敏、准确、多样的检测方法对有效防控猪瘟疫情极其重要,为了丰富现有的猪瘟病毒(CSFV)检测技术,本研究拟建立基于RAA-Cas13a的检测方法。基于全序列比对的基础上分别设计1对引物和两条cr RNA,对不同浓度的阳性质粒、阳性样品和7种其他猪病病毒样品进行RAA扩增,扩增产物以Cas13a酶切体系进行荧光检测;结果显示,Cas13a酶切体系可以放大普通RAA的检测信号,RAA-Cas13a可以将检测的灵敏度提高至102copies/μL,不能检出其他7种猪病病毒,检测变异系数小于5%,临床样本检测结果与荧光RT-PCR一致性高。结果表明,本研究建立CSFV的RAA-Cas13a灵敏度较高、特异性和重复性好,具有推广应用的潜力。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 检测 RAA Cas13a
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E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化 被引量：2
3
作者 尹彩霞 于少雄 +3 位作者 宋琨 李素 杨玉莹 仇华吉 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1995-2003,共9页
【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细... 【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 悬浮细胞系 吸附 内化
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高效制备霍乱弧菌菌影及其增强猪瘟疫苗免疫效果的研究
4
作者 姬生乐 韩美晴 +3 位作者 杜丽宏 彭名正 徐思艳 杨梦华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期696-700,738,共6页
为评价霍乱弧菌菌影(VCG)对猪瘟活疫苗及猪瘟病毒E2蛋白抗原区(BC和AD区)亚单位疫苗免疫增强效果的作用,本实验首先利用含有裂解质粒的霍乱弧菌制备VCG,通过对细菌裂解前后进行平板计数及透射电镜检测VCG裂解效果,结果显示所制备的VCG... 为评价霍乱弧菌菌影(VCG)对猪瘟活疫苗及猪瘟病毒E2蛋白抗原区(BC和AD区)亚单位疫苗免疫增强效果的作用,本实验首先利用含有裂解质粒的霍乱弧菌制备VCG,通过对细菌裂解前后进行平板计数及透射电镜检测VCG裂解效果,结果显示所制备的VCG裂解率高,且基本形成一个完整的细菌空壳。在确定最佳猪瘟活疫苗使用量后探究VCG对猪瘟活疫苗(CFS ST)免疫效果的影响,实验分别用VCG+CFS ST和CFS ST免疫家兔一次,设置对照组,并在免疫第42 d后攻毒。本研究还探究了VCG作为佐剂对猪瘟E2蛋白主要抗原区蛋白亚单位疫苗免疫效果的影响,实验分别用完全弗氏佐剂(CFA)和VCG联合E2蛋白主要抗原区蛋白,通过间隔两周的方式分4次免疫家兔,设置对照组,并在免疫第56 d后攻毒。通过阻断ELISA方法每周检测家兔血清的抗体阻断率,免疫后以500 RID50的猪瘟病毒弱毒株通过耳缘静脉注射方式对家兔攻毒。结果显示,50 RID50的猪瘟活疫苗组家兔血清抗体阻断率显著降低(p<0.001);VCG+CFS ST组家兔猪瘟抗体阻断率在免疫14 d后大部分时间点显著高于CFS ST组(p<0.05),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应;CFA(E2)组和VCG(E2)组的家兔猪瘟抗体阻断率均显著达到较高水平(p<0.001),并且攻毒后仅对照组出现定型热反应。以上结果表明VCG可作为免疫佐剂增强猪瘟活疫苗的免疫效果;VCG联合猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区亚单位疫苗在家兔中也具有较好的免疫效果。本研究为研发廉价高效的疫苗佐剂提供重要的实验依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 佐剂 霍乱弧菌菌影 亚单位疫苗 猪瘟活疫苗
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猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达 被引量：1
5
作者 谢金文 王金良 +4 位作者 董林 苗立中 管宇 高三阳 沈志强 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第1期10-13,共4页
为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶... 为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 克隆 原核表达 鉴定
原文传递
应用CSFV-E2基因噬菌体肽库筛选猪瘟病毒抗原表位
6
作者 汤波 范学政 +6 位作者 徐璐 王琴 黄伟 刘俊 沙莎 陈蕾 周远成 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2009年第4期12-15,共4页
采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位。运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多... 采用猪瘟单抗对猪瘟病毒石门株E2基因噬菌体随机肽库(SM-E2库)进行淘洗以研究猪瘟病毒E2抗原表位。运用猪瘟单克隆抗体WH303、WH211和M56对SM-E2库进行4轮生物淘洗,对阳性克隆再经噬菌体原位杂交、特异PCR测序分析,然后人工合成阳性多肽进行ELISA反应。经鉴定分析发现单抗WH303从SM-E2库中筛选得到一段CSFV特异的抗原多肽IECTAVSPTTLRTEVVKT,并且该段多肽与已知CSFV表位TAVSPTTLR极为相似;单抗WH211和M56未能筛选到包含CSFV序列的克隆。结果表明,利用靶基因噬菌体随机多肽库筛选抗原表位能够得到更接近于真实表位的抗原表位。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 抗原表位 噬菌体随机肽库
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4种猪瘟病毒抗体检测方法的比较 被引量：10
7
作者 马超英 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第10期128-131,共4页
为比较4种猪瘟病毒抗体检测方法的优缺点,应用正向间接血凝试验(IHA),间接ELISA、Dot-ELISA、胶体金免疫层析试纸条(GICA)4种方法分别对142份猪血清样品进行检测。结果表明,间接ELISA方法检出阳性样品119份,IHA检出阳性样品117份,Dot-EL... 为比较4种猪瘟病毒抗体检测方法的优缺点,应用正向间接血凝试验(IHA),间接ELISA、Dot-ELISA、胶体金免疫层析试纸条(GICA)4种方法分别对142份猪血清样品进行检测。结果表明,间接ELISA方法检出阳性样品119份,IHA检出阳性样品117份,Dot-ELISA检出阳性样品115份,GICA检出阳性样品109份。结果提示,在对猪瘟病毒抗体进行检测时,间接ELISA由于其灵敏性高,可作为首选检测方法,但操作时需要避免假阳性的出现;正向间接血凝试验虽然灵敏度稍低,对血清质量要求高,但结果准确,是猪瘟抗体检测必不可少的检测方法,适合个体检测;胶体金试纸条和dot-ELISA检测时间较短、操作简单、无需特殊仪器设配,由于受其敏感性较低所限,适合对畜群进行检测。 展开更多
关键词 猪瘟抗体 检测方法 优缺点
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基于磁致伸缩材料的猪瘟病毒无线免疫传感器
8
作者 郭星 高爽 +1 位作者 桑胜波 张文栋 《分析试验室》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期536-538,共3页
通过在磁致伸缩材料表面形成金-硫键自组装膜固载猪瘟多抗,构建了一种新型、灵敏、便携、低成本的猪瘟病毒无线免疫传感器。该传感器基于抗原抗体特异性结合使猪瘟病毒附着在磁致伸缩材料表面从而导致磁弹片共振频率降低的原理,通过测... 通过在磁致伸缩材料表面形成金-硫键自组装膜固载猪瘟多抗,构建了一种新型、灵敏、便携、低成本的猪瘟病毒无线免疫传感器。该传感器基于抗原抗体特异性结合使猪瘟病毒附着在磁致伸缩材料表面从而导致磁弹片共振频率降低的原理,通过测定共振频率偏移量实现对猪瘟病毒的无线检测。采用扫描电子显微镜(SEM)对抗体修饰及猪瘟病毒检测过程进行了表征,利用该传感器对不同浓度的猪瘟病毒进行检测,线性范围为0.5~2.5μg/m L,响应灵敏度为65 Hz/(μg·m L^(-1)),检出限为0.5μg/m L。 展开更多
关键词 免疫传感器 磁致伸缩材料 猪瘟病毒 抗体修饰
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