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沙眼衣原体转录激活因子GrgA与RNA聚合酶β'亚基的相互作用
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作者 石禹 包小峰 窦志华 《医学研究与战创伤救治》 CAS 北大核心 2024年第9期897-903,共7页
目的研究沙眼衣原体基因转录调控过程中转录激活因子GrgA与RNA聚合酶(RNAP)β'亚基相互作用的关系。方法制备沙眼衣原体RNA聚合酶(cRNAP)NH-β'(N末端携带His标签)质粒:根据GenBank中的基因序列设计特异性引物,以衣原体基因组DN... 目的研究沙眼衣原体基因转录调控过程中转录激活因子GrgA与RNA聚合酶(RNAP)β'亚基相互作用的关系。方法制备沙眼衣原体RNA聚合酶(cRNAP)NH-β'(N末端携带His标签)质粒:根据GenBank中的基因序列设计特异性引物,以衣原体基因组DNA(gDNA)为模板,聚合酶链式反应技术(PCR)扩增cRNAPβ'亚基的基因片段;采用同源重组法将基因片段插入到目的载体上构建表达质粒,同样方法制备β'亚单位和缺失亚单位质粒;cRNAPβ'亚基蛋白(包括亚单位和缺失亚单位)的表达:将构建的质粒转化ArcticExpress表达菌中,采用考马斯亮蓝染色法鉴定蛋白表达情况;cRNAPβ'亚基及其亚单位蛋白的纯化:采用固定化离子亲和层析法(IMAC)纯化得到相应蛋白;借助体外蛋白结合实验(Pull-down技术)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)分析鉴定出GrgA与cRNAPβ'亚基两者间相互结合的较为详细的某一段氨基酸序列。结果GrgA能与cRNAP的β'亚基结合;GrgA与cRNAP的β'亚基N端的(1-731)氨基酸序列有结合,与C端的(671-1396)氨基酸序列无结合。GrgA与β'亚基的(1-240)和(181-417)氨基酸序列有结合;与β'(360-598)、β'(533-731)氨基酸序列无结合。GrgA与β'△(1-180)和β'△(241-417)有结合,与β'△(1-417)无结合。结论GrgA能与cRNAP的β'亚基结合;cRNAP的β'亚基与GrgA的结合存在2个结合位点,分别位于β'亚基N末端的1-180和241-417位氨基酸序列。 展开更多
关键词 沙眼衣原体 crnap GrgA β'亚基 相互作用 融合蛋白
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