贵州省地方品种鸡禽白血病病毒流行株的亚型鉴定及其分子特征分析 被引量：8

1

作者 杨树青 王丽媛 +3 位作者 贠鲁祥 黄新 鞠孜敬 孙淑红 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期233-236,共4页

为了解贵州省9个地方品种鸡群中禽白血病病毒(ALV)流行株亚型与分子特征,本研究2016年从该省8个地区9个地方品种鸡群共采集380份鸡蛋样品。采集卵白用ELISA试剂盒检测ALV-P27抗原,阳性卵白接种CEF和DF1细胞分离病毒,培养7 d后检测细胞... 为了解贵州省9个地方品种鸡群中禽白血病病毒(ALV)流行株亚型与分子特征,本研究2016年从该省8个地区9个地方品种鸡群共采集380份鸡蛋样品。采集卵白用ELISA试剂盒检测ALV-P27抗原,阳性卵白接种CEF和DF1细胞分离病毒,培养7 d后检测细胞培养液中ALV-P27抗原,对感染细胞cDNA以4对ALV特异性引物进行PCR鉴定与分型。并选取9个鸡群的部分ALV分离株进行gp85基因的克隆测序与序列分析。结果表明,9个鸡群的卵白样品ALV-P27抗原阳性率为0~36%;阳性卵白的CEF和DF1细胞培养上清P27抗原检测结果相同,阳性率为26.8%(15/56),并鉴定出其亚型全部为J亚型(ALV-J)。已测序的21株ALV-J gp85基因序列与国内外ALV-J参考株同源性为86.6%~100%;进化树分析显示,21株ALV-J分离株在不同的分支,其进化关系和来源之间未发现明显规律。本研究表明,贵州省9个地方品种鸡群有6个存在ALV-J感染。其中,3个当地培育的品种鸡ALV感染率为0;而来自3个地区的绿壳蛋鸡ALV-P27抗原阳性率普遍较高(26.7%~36.0%)。本研究补充了我国禽白血病流行病学的数据并为该病的防制提供了调查依据。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 贵州 地方品种鸡 流行病毒株

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1株J亚群禽白血病病毒env基因克隆及生物信息学分析 被引量：1

2

作者 陈玫婷 郑从森 +6 位作者 梁泽贤 林巧儿 常传哲 周俊 冯军 李林林 覃丽梅 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1785-1795,共11页

【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行... 【目的】通过生物信息学方法分析1株禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的囊膜蛋白env的分子特征。【方法】利用鸡成纤维细胞(DF-1)培养疑似禽白血病病鸡的血清样品,通过ELISA和实时荧光定量PCR鉴定ALV亚群。对env基因PCR产物进行测序,利用SeqMan拼接env基因。将该env基因与国内外多个ALV亚群进行序列比对及遗传进化分析,并借助多种生物信息学软件对env蛋白进行分析,包括理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点、乙酰化位点、二级结构、三级结构、抗原决定簇和B细胞抗原表位预测。【结果】ALV-J毒株的env基因全长1719 bp,获得GenBank登录号为OP837418,其与J亚群ALV位于同一进化分支,相似性为89.3%~94.8%。该env蛋白有2个跨膜区,是由572个氨基酸组成的不稳定的亲水蛋白,不稳定系数预测值为43.49,总平均亲水性为―0.201;该env蛋白为非分泌蛋白,无信号肽,有17个N-糖基化修饰位点、77个O-糖基化修饰位点、42个磷酸化修饰位点、21个潜在抗原决定簇和9个连续碱基数超过10个的B细胞线性表位。该env蛋白的二级结构中无规则卷曲占比最大,为38.29%。【结论】env基因是导致ALV遗传变异的关键基因,其编码的囊膜蛋白env具有不稳定性,存在多个蛋白修饰位点和抗原表位。 展开更多

关键词 禽白血病病毒(alv) J亚群 ENV基因 生物信息学

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北京信鸽中1株禽白血病病毒的分离和鉴定

3

作者 张帅华 常建宇 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第10期65-69,共5页

为研究北京地区信鸽中禽白血病(AL)的流行情况,本试验从北京市沙河地区某市场抽样采集疑似AL信鸽血液样本共54份,通过检测p27抗原对其进行禽白血病病毒(ALV)鉴定;将分离株接种SPF鸡后检测其血清中ALV-Ab和ALV-J抗体,对分离株env基因进... 为研究北京地区信鸽中禽白血病(AL)的流行情况,本试验从北京市沙河地区某市场抽样采集疑似AL信鸽血液样本共54份,通过检测p27抗原对其进行禽白血病病毒(ALV)鉴定;将分离株接种SPF鸡后检测其血清中ALV-Ab和ALV-J抗体,对分离株env基因进行扩增和测序,与各亚型ALV参考株gp 85基因核苷酸序列进行同源性分析,并构建系统发育进化树。结果显示,从54份样本中分离得到1株ALV,命名为CAU1501。ALV-J抗体检测全部呈阴性,ALV-Ab抗体检测有4份呈阳性。CAU1501的gp 85基因核苷酸序列与2007年美国分离株PDRC-3249同源性最高,与国内2009年山东分离株SDAU09E2遗传亲缘性最近,结合抗体检测结果确定分离株CAU1501为A亚群ALV。本试验结果可为后续北京地区鸽群AL的防控和净化提供参考依据。 展开更多

关键词 信鸽 禽白血病病毒(alv) 聚合酶链式反应

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慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因敲除 被引量：1

4

作者 徐天鹏 吴思乐 +6 位作者 温健 韦义荣 李思佳 谢龙 虞霖田 宋中宝 陆阳清 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期2259-2266,共8页

【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列(KY235336)特点,分别在其5’和3’端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sg... 【目的】探索在慢羽鸡成纤维细胞中敲除ev21基因的可行性,净化鸡群内源性逆转录病毒,同时为快速培育缺失ev21基因的慢羽鸡配套系打下基础。【方法】根据ev21基因序列(KY235336)特点,分别在其5’和3’端各设计2个sgRNA,用于构建4种不同sgRNA的打靶质粒,筛选出在5’和3’端打靶效率较高的sgRNA。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑技术对ev21基因进行剪切,并通过同源重组方式以红色荧光蛋白(mCherry)的DNA片段(CAG-mCherry)替换ev21基因,实现对慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因定点敲除。【结果】在慢羽鸡成纤维细胞中能检测到ev21基因,构建的4种sgRNA(sgRNA1~sgRNA4)均能成功插入对应的打靶质粒中,经嘌呤霉素筛选及T7E1酶切检测,发现转染4种不同sgRNA打靶质粒后慢羽鸡成纤维细胞均有不同程度的死亡,其中又以sgRNA1和sgRNA3的基因敲除效率较高。同时针对同源位点左右同源臂构建表达mCherry的供体质粒,以其转染293T细胞12 h后均能表达出mCherry。以sgRNA1和sgRNA3打靶质粒及供体质粒共同转染慢羽鸡成纤维细胞,观察发现成纤维细胞内的mCherry持续表达,至转染后第30 d通过流式细胞仪分选收集红色荧光阳性成纤维细胞,并提取其总DNA进行PCR鉴定与基因测序,结果显示红色荧光阳性成纤维细胞中有目的片段(CAG-mCherry)插入,即以插入替换方式能实现对ev21基因的敲除。【结论】基于crispr/cas9基因编辑技术的基因敲除方法能成功敲除慢羽鸡成纤维细胞内源性白血病病毒ev21基因,为培育缺失ev21基因的慢羽鸡品系提供技术支持。 展开更多

关键词 慢羽鸡 禽白血病病毒(alv) ev21基因 CRISPR/Cas9 基因敲除

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禽白血病病毒p27抗原的原核表达及其结合性多肽的筛选

5

作者 姬向波 张立恒 +3 位作者 李新锋 曹天行 陈中卫 张春霞 《现代牧业》 2019年第4期28-31,共4页

为获取与禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)p27抗原高亲和力结合的特异性多肽,原核表达并制备了高纯度的ALV p27蛋白,以纯化的ALV p27蛋白包被ELISA板,用M13噬菌体随机进行筛选。经过4轮淘选,ELISA鉴定噬菌体单克隆抗体与ALV p27... 为获取与禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)p27抗原高亲和力结合的特异性多肽,原核表达并制备了高纯度的ALV p27蛋白,以纯化的ALV p27蛋白包被ELISA板,用M13噬菌体随机进行筛选。经过4轮淘选,ELISA鉴定噬菌体单克隆抗体与ALV p27蛋白的亲和力,筛选出4个与ALV p27蛋白具有高亲和力的噬菌体单克隆抗体进行DNA测序,并推导出多肽的氨基酸序列。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 噬菌体展示肽 P27抗原

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J亚群禽白血病病毒致病机理研究进展 被引量：8

6

作者 张帆帆 涂凌云 +6 位作者 李海琴 曾艳兵 康昭风 谭美芳 谭佳 方绍培 杨群 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期2288-2293,共6页

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是一种高致癌性反转录病毒,可引发髓性细胞性白血病及各种肿瘤性疾病,并产生免疫抑制,易继发细菌及其他病毒感染。长久以来,禽白血病给养禽业造成了巨大的经济损失,且没有有效的预防和治疗手段,仅依靠禽白血病... J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是一种高致癌性反转录病毒,可引发髓性细胞性白血病及各种肿瘤性疾病,并产生免疫抑制,易继发细菌及其他病毒感染。长久以来,禽白血病给养禽业造成了巨大的经济损失,且没有有效的预防和治疗手段,仅依靠禽白血病病毒的净化,仍不能有效控制禽白血病的流行和蔓延。本文主要阐述ALV-J病毒的感染、复制、致瘤及免疫抑制机制、宿主天然抗病毒过程及其分子机制,对需要进一步深入研究的目标和内容提出了展望。 展开更多

关键词 J亚群禽白血病病毒(alv-J) 致病机理 免疫抑制 抗病毒免疫

原文传递

鸡IFIT5对J亚群禽白血病病毒在DF-1细胞内复制的影响

7

作者 朱丽霖 王后坤 +4 位作者 陈雪阳 刘晶 梁雄燕 方春 杨玉莹 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期310-316,共7页

【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进... 【目的】制备鸡干扰素诱导蛋白含三角形四肽重复5(IFIT5)多克隆抗体,以探究IFIT5对J型禽白血病病毒(ALV-J)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以感染ALV-J的鸡脾脏组织细胞提取的RNA反转录获得的cDNA作为模板,对IFIT5基因进行PCR扩增,利用重组酶将纯化后的PCR产物和线性化载体进行连接,构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5并测序。将测序正确的重组质粒pET-28a-IFIT5转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,表达的融合蛋白His-IFIT5纯化后免疫6周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,通过Western blotting鉴定抗体的特异性,利用间接ELISA测定抗体的效价。将测序正确的重组质粒pcDNA5-flag-IFIT5转染DF-1细胞,24 h后接种ALV-J,通过Western blotting检测DF-1细胞中过表达IFIT5对ALV-J复制的影响。【结果】试验成功扩增到大小为1 440 bp的IFIT5基因,并成功构建重组质粒pET-28a-IFIT5和pcDNA5-flag-IFIT5。pET-28a-IFIT5可以表达约56 ku的可溶性蛋白His-IFIT5,Western blotting结果显示,制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的IFIT5蛋白,效价为1∶32 000。pcDNA5-flag-IFIT5能在DF-1细胞中高效表达,且在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。【结论】本研究制备的鼠抗IFIT5蛋白多克隆抗体具有较高的反应性和特异性;在DF-1细胞中过表达IFIT5可以促进ALV-J复制。本试验结果为深入研究IFIT5蛋白的生物学功能提供参考。 展开更多

关键词 IFIT5基因 J型禽白血病病毒(alv-J) 原核表达 多克隆抗体

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电子显微镜技术对马立克氏病病毒的监测 被引量：1

8

作者 张坦 蔡红 +1 位作者 韩凌霞 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期822-824,共3页

为了及时监测马立克氏病病毒(MDV)在培养、驯化及制苗过程中其他微生物的污染,我们利用电子显微镜技术对送检材料进行了监测。结果在不同批次的送检材料中分别发现了支原体、网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、鸡贫血病病毒等,表... 为了及时监测马立克氏病病毒(MDV)在培养、驯化及制苗过程中其他微生物的污染,我们利用电子显微镜技术对送检材料进行了监测。结果在不同批次的送检材料中分别发现了支原体、网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、鸡贫血病病毒等,表明利用电子显微镜技术可以对MDV培养物的纯度进行直观快速的检测。 展开更多

关键词 电子显微镜 马立克氏病病毒 网状内皮组织增生症病毒 禽白血病病毒 鸡贫血病毒

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E3泛素连接酶RNF185对A亚群禽白血病病毒体外复制的影响 被引量：3

9

作者 刘晶 陈雪阳 +1 位作者 曾扬 杨玉莹 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第11期4364-4371,共8页

【目的】环指蛋白185(ring finger protein 185,RNF185)是Ring家族E3泛素连接酶的一员。试验旨在探明鸡源RNF185对A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A,ALV-A)体外复制的影响,为进一步研究鸡源RNF185对ALV-A致病性的影... 【目的】环指蛋白185(ring finger protein 185,RNF185)是Ring家族E3泛素连接酶的一员。试验旨在探明鸡源RNF185对A亚群禽白血病病毒(Avian leukemia virus subgroup A,ALV-A)体外复制的影响,为进一步研究鸡源RNF185对ALV-A致病性的影响和介导的致瘤机制提供参考。【方法】参考GenBank中已公布的鸡RNF185基因(登录号:NP_001007841)序列分别设计RNF185过表达引物和RNF185单链shRNA,通过PCR扩增RNF185基因及合成双链shRNA,将其分别克隆至真核表达载体psi-flag和干扰载体pLKO.1-GFP,并使用PCR、双酶切和测序等方法验证重组质粒。使用Western blotting验证重组质粒的表达和干扰效果,并使用CCK-8试剂盒检测重组质粒对DF-1细胞活性的影响。在RNF185过表达和干扰后的DF-1细胞中分别接种10~4半数组织感染剂量(TCID)ALV-A(rHB2015012)病毒液,于接种完成后3、4和5 d收取细胞,并使用Western blotting检测ALV-A的病毒载量。【结果】PCR成功扩增出RNF185基因,单链shRNA经退火后形成双链shRNA,并成功构建重组质粒psi-flag-RNF185、pLKO.1-RNF185-1和pLKO.1-RNF185-2。Western blotting结果表明,构建的过表达和干扰质粒能够在DF-1细胞中稳定表达和干扰RNF185。CCK-8结果表明,过表达和干扰RNF185不影响DF-1细胞的活性。RNF185过表达可以促进ALV-A在DF-1细胞中的复制,干扰RNF185表达可以抑制ALV-A在DF-1细胞中的复制。【结论】本研究构建了可以在DF-1细胞中高效表达和干扰RNF185的过表达质粒和干扰质粒,RNF185对DF-1细胞增殖无明显影响,能够促进ALV-A(rHB2015012)在体外的复制。 展开更多

关键词 环指蛋白185(RNF185) A亚群禽白血病病毒(alv-A) 病毒复制

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绿壳蛋鸡MDV与J亚群外源性ALV混合感染病原的鉴定及主要基因序列分析 被引量：3

10

作者 张喜懿 温贵兰 +3 位作者 文明 欧德渊 陈广 张小波 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第13期68-74,147,共8页

为了确定贵州省某养殖场病死绿壳蛋鸡的发病原因,试验对送检的病死鸡进行剖检观察,无菌采集病变组织提取核酸并进行基因克隆及测序,分析同源性并构建遗传进化树。结果表明:3只病死鸡剖检可见脾脏肿大、质脆;肝脏肿大,有肿瘤结节;腺胃肿... 为了确定贵州省某养殖场病死绿壳蛋鸡的发病原因,试验对送检的病死鸡进行剖检观察,无菌采集病变组织提取核酸并进行基因克隆及测序,分析同源性并构建遗传进化树。结果表明:3只病死鸡剖检可见脾脏肿大、质脆;肝脏肿大,有肿瘤结节;腺胃肿大。马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)核酸检测仅MDV meq基因出现与预期片段大小相符的特异性扩增条带;禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)分离鉴定仅ALV J gp85基因出现与预期片段大小相符的特异性扩增条带;将目的片段克隆至pMD19-T载体上,经测序获得3个MDV meq基因片段和3个ALV J gp85基因片段,核苷酸序列大小分别约为1020,930 bp;获得的3株MDV毒株和3株ALV毒株与GenBank中相应参考毒株的核苷酸序列同源性分别为98.6%~100%、46.1%~99.6%,分别与参考毒株G2株和HPRS103株在同一分支上,亲缘关系较近。说明贵州省某养殖场鸡只的死亡原因是MDV与J亚群外源性ALV混合感染所致。 展开更多

关键词 绿壳蛋鸡 马立克病病毒(MDV) J亚群外源性禽白血病病毒(alv-J) 混合感染 病原鉴定 序列分析

原文传递

两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救

11

作者 王淼 陈雪阳 +2 位作者 王兴明 梁雄燕 杨玉莹 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第10期3764-3770,共7页

【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,... 【目的】为探明引起禽白血病病毒K亚型(ALV-K)两不同毒株之间致瘤性差异的原因,进一步探索ALV-K的致病机理,实现两株ALV-K重组病毒感染性克隆的构建及病毒拯救。【方法】以前期构建的ALV-K毒株HB2018003和HB2015032的感染性克隆为模板,PCR扩增分别获取两毒株单独的5′-端长末端重复序列(5′-LTR)基因片段和剩余目的基因片段。切胶回收目的片段后将两毒株的5′-LTR互换,通过同源重组的方法获得连接产物。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后涂布Amp抗性平板过夜培养,挑取PCR鉴定为阳性的菌落提取重组质粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并送检测序。将PCR和测序鉴定正确的重组质粒转染至易感细胞DF-1中盲传3代,使用群特异性抗原P27 ELISA、多重PCR和间接免疫荧光等方法对拯救的病毒进行检测。【结果】测序和重组感染性克隆PCR鉴定的结果表明成功构建了5′-LTR互换的重组质粒,多重PCR结果显示在目的片段大小处出现ALV-K预期条带,未出现ALV-A和ALV-J条带,间接免疫荧光试验结果显示接种拯救病毒的DF-1细胞出现明显的亮绿荧光,阴性对照则没有出现荧光。综合以上结果,说明两株重组病毒拯救成功,并将其分别命名为rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。【结论】本研究采用同源重组的方法构建了5′-LTR互换的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003,并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。 展开更多

关键词 禽白血病病毒K亚型(alv-K) 重组病毒 感染性克隆 病毒拯救

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