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应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统研究B细胞中转录因子T-bet的调控作用
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作者 韩夏夏 顾霜霜 +1 位作者 戴黛 沈南 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期433-442,共10页
目的·通过优化后的CRISPR/Cas9基因编辑系统,研究原代B细胞中转录因子T-bet对抗体类别转换的调控作用。方法·系统性分析GEO公共数据库中体外诱导分化的B细胞转录组测序结果,探索转录因子T-bet对抗体类别转换的调控。构建靶向... 目的·通过优化后的CRISPR/Cas9基因编辑系统,研究原代B细胞中转录因子T-bet对抗体类别转换的调控作用。方法·系统性分析GEO公共数据库中体外诱导分化的B细胞转录组测序结果,探索转录因子T-bet对抗体类别转换的调控。构建靶向基因为Tbx21(T-box 21,编码T-bet)的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)反转录病毒表达载体,使用Plat-E细胞系作为病毒包装细胞系获得装有sg-Tbx21质粒的反转录病毒并对其浓缩。使用B细胞受体抗体、抗CD40抗体和Toll样受体激动剂体外协同刺激Cas9转基因小鼠的脾脏B细胞,感染高滴度反转录病毒颗粒实现基因编辑。流式细胞术分选感染细胞,提取基因组DNA进行PCR扩增后对靶向序列进行测序,利用ICE CRISPR分析工具计算基因敲除效率。体外诱导B细胞分化为浆细胞,采用ELISA检测基因编辑后B细胞培养上清液中IgM、IgG2c、IgG3抗体类别的丰度,通过独立样本t检验比较sg-NC组与sg-Tbx21组细胞上清液中抗体水平的差异。结果·①经分析GEO数据库发现,γ干扰素可以诱导B细胞中Tbx21基因的表达,且在T-bet的转录调控下,B细胞展现抗体类别转换相关通路活化的转录组特征。②使用浓缩后的高滴度病毒感染激活的B细胞,可以构建高效的反转录病毒感染原代B细胞体系。③Cas9转基因小鼠原代B细胞转染sg-Tbx21质粒后成功实现Tbx21基因敲除,敲除效率约为59%。④在体外诱导B细胞分化为浆细胞的条件下,sg-Tbx21转染后的B细胞培养上清液中IgG2c水平显著降低(P=0.000),IgM和IgG3的水平无明显的变化。结论·通过浓缩反转录病毒和协同刺激激活原代B细胞的方式可提高sgRNA递送的效率,在Cas9转基因小鼠原代B细胞中敲除Tbx21基因;应用这一系统证明了T-bet敲除后阻碍了IgG2c抗体类别的产生。 展开更多
关键词 小向导RNA 反转录病毒 B细胞 基因编辑 T-BET 抗体类别转换
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