基于特征多肽抗原的阿胶基原鉴定

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作者 袁陈婷 杨容 +6 位作者 王立玮 景凌洁 陈璐阳 加羊卓玛 孙小祥 孙锦秀 杨欢 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1214-1219,共6页

目的 以特征多肽为半抗原并制备多克隆抗体,鉴定阿胶原材料基原。方法 经文献调研及数据库比对筛选特征多肽,将多肽抗原与血蓝蛋白偶联并免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过ELISA、dot blot和Western blot分析与验证多克隆抗体的产生、... 目的 以特征多肽为半抗原并制备多克隆抗体,鉴定阿胶原材料基原。方法 经文献调研及数据库比对筛选特征多肽,将多肽抗原与血蓝蛋白偶联并免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过ELISA、dot blot和Western blot分析与验证多克隆抗体的产生、效价及特异性。结果 筛选所得5个特征多肽序列均具有T细胞表位和B细胞表位,亲水性-1~0,二级结构大多为无规则卷曲。多肽抗原ECS1、ECS3~ECS5在二次加强免疫后,效价分别为1∶6 400、1∶400、1∶12 800和1∶800。制备所得的多克隆抗体之间不产生交叉反应,而且多克隆抗体Ab-ECS3与驴皮及其伪品蛋白的结合显现出较大差异。结论 以特征多肽为半抗原制备所得的多克隆抗体可通过Western blot对驴皮进行真伪鉴别,为胶类中药的基原鉴定提供了参考。 展开更多

关键词 阿胶 特征多肽 多肽抗原 多克隆抗体 western blot 基原鉴定

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人心肌肌钙蛋白I的纯化及鉴定 被引量：6

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作者 卞智萍 杨笛 +3 位作者 顾春荣 徐晋丹 杨国平 张寄南 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期9-11,共3页

目的　提取和纯化人心肌肌钙蛋白I。方法　心室肌经匀浆、离心、盐析提取 ,CMSephadexC 5 0柱层析 ,DEAESephadexA 5 0柱层析制备人cTnI ;经 (cTnI)活性检测、SDS PAGE、westernblot鉴定。结果　从 6 5 g湿重心肌中获得 4 .1mgcTnI ,分... 目的　提取和纯化人心肌肌钙蛋白I。方法　心室肌经匀浆、离心、盐析提取 ,CMSephadexC 5 0柱层析 ,DEAESephadexA 5 0柱层析制备人cTnI ;经 (cTnI)活性检测、SDS PAGE、westernblot鉴定。结果　从 6 5 g湿重心肌中获得 4 .1mgcTnI ,分子量约为 2 4 0 0 0 ,纯度约为 84 %。结论　纯化的cTnI可被cTnI单克隆抗体特异识别 ,本实验从人心肌中成功制备cTnI。 展开更多

关键词 人心肌肌钙蛋白I 纯化 鉴定 急性心肌梗死 诊断

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非洲猪瘟病毒K205R蛋白的原核表达与单克隆抗体制备 被引量：1

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作者 陈寅龙 郑南南 +6 位作者 吴宏举 侯浩宇 李潮 张昂克 韩世充 吴亚楠 杜永坤 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期1-7,共7页

为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R... 为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R蛋白。将纯化出的蛋白乳化后免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选出来的单克隆细胞注射至小鼠腹腔中,待小鼠腹部膨大时收集腹水,通过ELISA方法鉴定腹水效价、Western blot和IFA鉴定单克隆抗体特异性及反应原性,并对单克隆抗体亚型进行鉴定。经SDS-PAGE鉴定,重组ASFV K205R蛋白成功表达。Western blot分析显示,His标签抗体能够特异性识别重组表达的ASFV K205R蛋白,表明其具有良好的特异性以及反应原性。通过细胞融合和细胞筛选得到1株能稳定分泌抗ASFV K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1C3G6。ELISA检测腹水中抗体效价为1∶100000。Western blot和IFA鉴定结果显示单克隆抗体1C3G6与K205R蛋白反应性良好。通过亚型鉴定,单克隆抗体1C3G6的重链为IgG2b类,轻链为Kappa型。经Western blot和IFA鉴定,筛选得到的1C3G6单克隆抗体可以特异性识别原核系统和真核系统表达的K205R蛋白,说明该抗体具有良好的特异性。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 K205R蛋白 原核表达 单克隆抗体 western blot鉴定

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非洲猪瘟病毒K145R蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备 被引量：4

4

作者 耿笑林 孙杰 +8 位作者 王彦伟 黄甜 刘鹏 曹红梅 逄文强 郝丽影 邓均华 黄玉欣 田克恭 《河南农业科学》 北大核心 2021年第8期154-159,共6页

为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫诊断学试剂,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组K145R蛋白,制备并鉴定K145R蛋白单克隆抗体。结果显示,成功构建pET28a-K145R表达载体,表达得到大小约为17 ku可溶性的重组K145R蛋白。Western blot分析证实,重组... 为研发非洲猪瘟病毒(ASFV)的免疫诊断学试剂,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组K145R蛋白,制备并鉴定K145R蛋白单克隆抗体。结果显示,成功构建pET28a-K145R表达载体,表达得到大小约为17 ku可溶性的重组K145R蛋白。Western blot分析证实,重组K145R蛋白与ASFV阳性血清有良好的反应性。经细胞融合、筛选,得到单克隆抗体1D4;ELISA检测其效价为1∶5120000;亚类鉴定其重链为IgG2a,轻链为κ;Western blot鉴定其能特异性识别重组K145R蛋白;IFA检测其能与ASFV反应。综上,实现K145R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并制备单克隆抗体。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 K145R蛋白 原核表达 western blot鉴定 单克隆抗体

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非洲猪瘟病毒K196R和A240L蛋白的可溶性表达及酶活力分析 被引量：2

5

作者 李鹏昊 梁严予 +3 位作者 王彦伟 关洋 逄文强 田克恭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期70-75,共6页

旨在提供可用候选抗原蛋白,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的诊断及免疫预防研究。将ASFV SY18株K196R和A240L蛋白的编码基因进行密码子优化,并在其N端添加促溶标签进行融合表达;TEV酶切后利用亲和层析纯化目的蛋白... 旨在提供可用候选抗原蛋白,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的诊断及免疫预防研究。将ASFV SY18株K196R和A240L蛋白的编码基因进行密码子优化,并在其N端添加促溶标签进行融合表达;TEV酶切后利用亲和层析纯化目的蛋白,并通过Western blot和酶活检测试剂盒对其反应性和体外酶活力进行鉴定。结果显示,K196R和A240L蛋白分别通过添加SUMO和MBP标签实现了可溶性表达,标签去除后蛋白大小分别为22 kD和27 kD左右;Western blot结果显示,K196R和A240L蛋白均能够与ASF阳性血清发生较好的特异性反应;酶活检测结果表明,二者均具有一定的体外酶催化活性。利用大肠杆菌表达的ASFV K196R和A240L可溶性蛋白,具有较好的反应性和一定的体外酶催化活性,可为ASFV的诊断及蛋白的相关功能研究提供一定的依据。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 K196R蛋白 A240L蛋白 可溶性表达 western blot鉴定 酶活力分析

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重组人促卵泡激素(rhFSH)制剂的SDS-PAGE/Western blot鉴别方法研究 被引量：1

6

作者 梁成罡 毛歆 +2 位作者 沈舒 李晶 杨化新 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1611-1614,共4页

目的:建立可用于不同剂型重组人促卵泡激素(rhFSH)产品质量控制的特异性SDS-PAGE/Western blot鉴别方法。方法:用SDS-PAGE电泳分离由不同生产企业生产的不同剂型rhFSH产品,通过半干电泳将凝胶上的待测蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜),采... 目的:建立可用于不同剂型重组人促卵泡激素(rhFSH)产品质量控制的特异性SDS-PAGE/Western blot鉴别方法。方法:用SDS-PAGE电泳分离由不同生产企业生产的不同剂型rhFSH产品,通过半干电泳将凝胶上的待测蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜),采用特异性抗体在NC膜上进行免疫杂交。通过检测灵敏度、线性和专属性试验,进行方法学考察。结果:对rhFSH特异性检测灵敏度可达5ng;对3个厂家生产的3种注射液、1种注射用冻干制剂检测,均可得到阳性结果,且试验结果不受不同剂型中的防腐剂、稳定剂和其他辅料干扰;用本法对等量的其他重组糖蛋白激素如重组人促黄体激素(rhLH)、重组人绒促性素(rhCG)测定结果均为阴性。结论:本方法灵敏度高、专属性强,可作为rhFSH的特异性鉴别方法,用于不同剂型rhFSH产品的质量控制。 展开更多

关键词 western blot 重组人促卯泡激素(rhFSH) 免疫鉴别 质量控制

原文传递

重组细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶的表达、复性及鉴定

7

作者 王玉姣 王浩 +4 位作者 赵嘉庆 何鑫 王程铖 王强 赵巍 《宁夏医科大学学报》 2014年第4期409-413,F0004,共6页

目的通过原核表达细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶(EgmMDH),获取高纯度的可溶性的重组细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)。方法从细粒棘球蚴(中国大陆株)中获得基因mdh并克隆到原核表达载体pET28a;通过IPTG诱导表达线粒... 目的通过原核表达细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶(EgmMDH),获取高纯度的可溶性的重组细粒棘球蚴线粒体苹果酸脱氢酶(rEgmMDH)。方法从细粒棘球蚴(中国大陆株)中获得基因mdh并克隆到原核表达载体pET28a;通过IPTG诱导表达线粒体苹果酸脱氢酶(mMDH),进而采用亲和层析的方法纯化该包涵体目的蛋白并复性,获得可溶性目的蛋白rEgmMDH;利用细粒棘球蚴(中国大陆株)攻击感染家兔后获得血清;分别采用抗原头蚴兔血清和抗His-Tag鼠单克隆抗体对可溶性rEgmMDH进行Western blot鉴定。结果①成功构建原核表达载体pET28a-mMDH/BL21;②通过亲和层析及复性,获得高纯度可溶性目的蛋白rEgmMDH;③Western blot结果表明,抗原头蚴兔血清和抗His-Tag鼠单克隆抗体可分别特异性鉴定该复性可溶性rEgmMDH。结论通过本研究获得高纯度可溶性rEgmMDH,为进一步研究其在细粒棘球蚴感染宿主过程中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 细粒棘球蚴 重组细粒棘球蚴(中国大陆株)线粒体苹果酸脱氢酶 蛋白纯化 western blot鉴定

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柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(EtMIC1)基因的原核表达与重组蛋白的免疫原性分析

8

作者 张圳 王松 +3 位作者 孙铭飞 胡建和 王丹妮 朱惠丽 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2023年第20期77-82,共6页

为了解原核表达柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(Eimeria tenella microneme 1,EtMIC1)重组蛋白的免疫原性,试验以柔嫩艾美耳球虫广东株孢子化卵囊为材料,首先采用PCR技术扩增去除信号肽的EtMIC1基因,将其插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重... 为了解原核表达柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(Eimeria tenella microneme 1,EtMIC1)重组蛋白的免疫原性,试验以柔嫩艾美耳球虫广东株孢子化卵囊为材料,首先采用PCR技术扩增去除信号肽的EtMIC1基因,将其插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达载体,然后将重组原核表达载体pET32a(+)-EtMIC1转化至大肠杆菌T7pLysY感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,最后对重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定。结果表明:PCR扩增出大小为2055 bp的去信号肽EtMIC1基因片段,与预期结果一致;构建的重组原核表达载体pET32a(+)-EtMIC1可在大肠杆菌T7pLysY感受态细胞中表达,重组蛋白分子质量大小约为93 ku,主要表达在上清液中,可被自然感染抗柔嫩艾美耳球虫鸡血清和EtMIC1重组蛋白多克隆抗体特异性识别。说明试验成功表达了EtMIC1重组蛋白,原核表达的EtMIC1重组蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 EtMIC1 原核表达 免疫原性 SDS-PAGE分析 western-blot鉴定

原文传递

日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon亚型基因的表达及鉴定

9

作者 唐小牛 汪学龙 沈继龙 《中国寄生虫病防治杂志》 CSCD 2003年第6期358-361,共4页

目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合... 目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合成 1对引物 ,以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板 ,用RT PCR法合成日本血吸虫大陆株 14 3 3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK Sj14 3 3 ,转染到大肠杆菌BL2 1,双酶切鉴定后 ,通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL2 1中进行表达及Western blot鉴定。　结果　RT PCR产物、pGEM T Sj14 3 3及pBK Sj14 3 3分别经双酶切均获得一特异性基因片段 ,其表达产物经SDS PAGE及Western blot鉴定后其分子质量为 3 2ku ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。　结论真核表达重组质粒 pBK Sj14 3 3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为 3 2ku融合蛋白 ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。 展开更多

关键词 日本血吸虫 epsilon亚型 基因表达 western-blot鉴定 大肠杆菌

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简单差示蛋白获取法鉴别2种海蛇的应用

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作者 曾洪辉 杨燕军 +1 位作者 何雅军 吴谦 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 2006年第2期120-122,共3页

目的建立简单差示蛋白法,获取两种海蛇的特征蛋白用作专属鉴别。方法采用SDS-PAGE与West-ern-blot结合分析并取差示蛋白直接测序。结果确认1号海蛇的特征蛋白为14.6kD及8.7kD两个组分,2号海蛇的特征蛋白为16.7kD及10.2kD两个组分,并完成... 目的建立简单差示蛋白法,获取两种海蛇的特征蛋白用作专属鉴别。方法采用SDS-PAGE与West-ern-blot结合分析并取差示蛋白直接测序。结果确认1号海蛇的特征蛋白为14.6kD及8.7kD两个组分,2号海蛇的特征蛋白为16.7kD及10.2kD两个组分,并完成14.6kD及10.2kD氨基酸测序。结论采用一维电泳结合抗原分析,方法简单,可以获取差示蛋白用于中药材基原鉴别。 展开更多

关键词 海蛇 鉴别 差示蛋白显示 种属特征蛋白 western—blot

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免疫印迹技术在参属药材鉴别中的应用

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作者 俞瑜 吴谦 杨燕军 《中药新药与临床药理》 CAS CSCD 2000年第3期164-166,共3页

采用免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）技术，对Ｐａｎａｘ属西洋参、人参及三七进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ指纹图谱分析。确定了 Ｐａｎａｘ属药材的特征指纹图谱。提示 Ｗｅｓｔｅｒ... 采用免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ）技术，对Ｐａｎａｘ属西洋参、人参及三七进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ指纹图谱分析。确定了 Ｐａｎａｘ属药材的特征指纹图谱。提示 Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ可用于Ｐａｎａｘ属药材，特别是西洋参的专属性鉴别。 展开更多

关键词 免疫印迹技术 西洋参 人参 三七 中药鉴别

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