双重荧光RPA扩增方法快速鉴别两种血清型水泡性口炎病毒 被引量：7

1

作者 林彦星 曹琛福 +4 位作者 曾少灵 杨俊兴 吕建强 刘丽娟 花群义 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期712-719,共8页

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,根据水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSVNJ)相对保守的L基因为靶序列设计并筛选出两套特异性的引物和探针,建立了快速鉴别检测水泡性口炎病毒两种血清型的双重荧光RT-RPA方法。试验... 本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,根据水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSVNJ)相对保守的L基因为靶序列设计并筛选出两套特异性的引物和探针,建立了快速鉴别检测水泡性口炎病毒两种血清型的双重荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测核酸浓度为12.7fg/μL;简便快速,反应时间短(<15min),且重复性好。利用所建立方法对124份临床样品进行检测,结果与双重荧光RT-PCR一致。本文为VSV-IND和VSV-NJ的快速鉴别检测提供一种新方法,尤其适合现场检疫或基层实验室的快速检测。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒(vsv) 重组酶聚合酶扩增(RPA) 鉴别检测

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小檗胺的体外抗病毒作用及基于Ⅰ型干扰素通路的机制研究 被引量：3

2

作者 王浩嘉 李森 +4 位作者 连瑞 董秋童 何昱廷 贾鑫 王遥 《药物评价研究》 CAS 2023年第6期1185-1192,共8页

目的观察小檗胺的体外抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)通路的抗病毒天然免疫反应探讨其作用机制。方法CCK-8法检测0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000μmol·L^(-1)的小檗胺对A549细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白... 目的观察小檗胺的体外抗病毒作用,并基于Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)通路的抗病毒天然免疫反应探讨其作用机制。方法CCK-8法检测0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000μmol·L^(-1)的小檗胺对A549细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV-GFP)以0.05的感染复数(MOI)感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的小檗胺2.5、5.0、10.0μmol·L^(-1)对GFP阳性细胞比例的影响;VSV感染A549细胞,Western blotting检测小檗胺对VSV病毒G蛋白表达的影响;小檗胺使用预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-GFP在A549细胞中复制的影响;分别使用甲型流感病毒(H1N1)(MOI=0.05),脑心肌炎病毒(EMCV)(MOI=3)和单纯疱疹病毒1型(HSV-1)(MOI=1)感染A549细胞,同时给药共同孵育12 h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小檗胺对病毒RNA表达的影响;小檗胺10.0μmol·L^(-1)处理A549细胞24 h,进行转录组测序分析;10μmol·L^(-1)小檗胺处理MEF细胞12 h后,qRT-PCR法检测Ifnb1、Ifit1、Ifit2、Ifi44基因的mRNA表达;利用IFN刺激性DNA(ISD)转染THP-1细胞,预先激活IFN-I信号通路,4~6 h加入小檗胺5、10μmol·L^(-1)处理12 h,qRT-PCR法检测IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44基因的mRNA表达。结果浓度为10μmol·L^(-1)及以下时,小檗胺对A549细胞均未显示出明显的细胞毒性;与模型组相比,小檗胺剂量相关性地减少了VSV-GFP阳性细胞的比例(P<0.05、0.001),明显减少了病毒的VSV-G蛋白表达;小檗胺对VSV的吸附过程没有影响,而预处理或吸附后给药可以显著抑制病毒复制;与模型组比较,小檗胺剂量相关性地抑制了H1N1、EMCV和HSV-1的病毒基因表达(P<0.001);转录组测序和qRT-PCR结果表明,小檗胺促进细胞基于IFN-I信号通路的抗病毒免疫激活;在ISD刺激后,小檗胺诱导更高水平的IFNB1、IFIT1、IFIT2、IFI44 mRNA表达(P<0.05、0.01、0.001)。� 展开更多

关键词 小檗胺 水疱性口炎病毒(vsv) 甲型流感病毒(H1N1) 脑心肌炎病毒(EMCV) 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) 抗病毒免疫 干扰素 干扰素刺激基因

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北豆根总生物碱的抗病毒感染功能与机制

3

作者 王雪娇 李琪琪 +5 位作者 禹艳丽 刘霞 李敏 刘哲 贾鑫 王遥 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期37-44,共8页

目的:探讨北豆根总生物碱的抗病毒感染作用及其与Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路的关系。方法:通过倒置荧光显微镜、流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)等方法检测北豆根总生物碱对甲... 目的:探讨北豆根总生物碱的抗病毒感染作用及其与Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)信号通路的关系。方法:通过倒置荧光显微镜、流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)等方法检测北豆根总生物碱对甲型流感病毒(H1N1)、水疱性口炎病毒(VSV)和脑心肌炎病毒(EMCV)在细胞内复制的影响。构建H1N1病毒感染小鼠模型,将小鼠分为空白组、H1N1模型组、北豆根总生物碱组(10、20、30 mg·kg^(-1))和奥司他韦组(40 mg·kg^(-1)),研究北豆根总生物碱对感染小鼠的体质量和生存率的影响。Real-time PCR检测北豆根总生物碱对细胞中IFN-Ⅰ通路的激活作用,并在干扰素受体1(IFNAR1)敲除的A549细胞(IFNAR1^(-/-)-A549)检测北豆根总生物碱抗病毒感染作用与IFN-Ⅰ通路的关系。结果:与空白组比较,病毒感染模型组中的病毒大量增殖(P<0.01);与模型组比较,北豆根总生物碱在体外显著抑制H1N1、VSV和EMCV的复制(P<0.01),在体内抑制H1N1病毒感染小鼠体质量降低,提升小鼠生存率(P<0.05)。此外,北豆根总生物碱激活IFN-Ⅰ通路并依赖该通路发挥抗病毒感染作用。结论:北豆根总生物碱通过激活IFN-Ⅰ通路发挥体内和体外的抗病毒感染作用。 展开更多

关键词 北豆根总生物碱 甲型流感病毒(H1N1) 水疱性口炎病毒(vsv) 脑心肌炎病毒(EMCV) 抗病毒免疫 Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)

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异土木香内酯体外抗病毒作用与机制研究

4

作者 孔令东 刘霞 +6 位作者 李艺颖 王靳勇 董秋童 李敏 禹艳丽 刘哲 贾鑫 《药物评价研究》 CAS 北大核心 2024年第3期521-528,共8页

目的研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制。方法CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000μmol·L^(-1)的异土木香内酯处理24 h对人非小细胞肺癌细胞系(A549)细胞活力的影响;表达绿色荧... 目的研究异土木香内酯的体外抗病毒作用及机制。方法CCK-8法检测0.125、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000μmol·L^(-1)的异土木香内酯处理24 h对人非小细胞肺癌细胞系(A549)细胞活力的影响;表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV-eGFP)以0.02的感染复数(MOI)感染A549细胞制备模型,流式细胞术检测共同孵育12 h的异土木香内酯5、10、20μmol·L^(-1)对GFP阳性细胞率的影响;VSV感染(MOI=0.1)A549细胞,Western blotting检测异土木香内酯处理16 h对VSV病毒G蛋白表达的影响;分别使用甲型流感病毒(H1N1,MOI=0.1)、脑心肌炎病毒(EMCV,MOI=0.1)感染A549细胞,同时给药共同孵育8 h后,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测土木香内酯对病毒RNA表达的影响;异土木香内酯分别以预处理12 h、病毒吸附过程中给药2 h、病毒吸附后给药10 h 3种不同方式给药,通过流式细胞术检测其对VSV-eGFP在A549细胞中复制的影响;异土木香内酯20μmol·L^(-1)处理胚胎成纤维(MEF)细胞12 h,进行转录组测序分析;异土木香内酯5、10、20μmol·L^(-1)处理MEF细胞12 h,qRT-PCR检测干扰素α1(Ifna1)、干扰素β1(Ifnb1)、干扰素诱导蛋白44(Ifi44)、干扰素刺激基因15(Isg15)的mRNA表达。结果异土木香内酯对A549细胞的半数抑制浓度(IC_(50))为51.01μmol·L^(-1);与模型组比较,流式结果显示异土木香内酯显著减少VSV-eGFP阳性细胞率(P<0.001),但对病毒的吸附过程没有影响,药物预处理及吸附后给药显著抑制VSV病毒复制(P<0.01、0.001);qRT-PCR结果显示异土木香内酯显著降低H1N1、EMCV病毒的mRNA水平(P<0.001);Western blotting结果显示异土木香内酯显著抑制VSV的G蛋白表达(P<0.001);转录组测序分析和qRT-PCR结果表明,异土木香内酯促进I型干扰素通路的激活,并诱导Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15(P<0.001)表达。结论异土木香内酯通过促进基于干扰素通路的抗病毒天然免疫激活,发挥抑制病毒复 展开更多

关键词 土木香 异土木香内酯 水疱性口炎病毒(vsv) 甲型流感病毒(H1N1) 脑心肌炎病毒(EMCV) 抗病毒免疫 干扰素 干扰素刺激基因

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4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究 被引量：3

5

作者 高志参 李照耀 +2 位作者 周静 陈婧 周斌 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期690-696,共7页

[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Wester... [目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。 展开更多

关键词 MX蛋白 不同种属 水疱性口炎病毒(vsv) 抗病毒

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隐丹参酮体外抗病毒作用及机制研究 被引量：2

6

作者 成翠芹 马文福 +4 位作者 李琪琪 孔令东 谢芳 贾鑫 王遥 《药物评价研究》 CAS 2022年第9期1706-1715,共10页

目的探索隐丹参酮在细胞水平的抗病毒作用,从药物调控宿主抗病毒免疫角度,阐释隐丹参酮抑制病毒复制的分子机制。方法通过流式细胞术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹实验(Western blotting)等方法检测隐丹参酮对水疱性口炎病毒(V... 目的探索隐丹参酮在细胞水平的抗病毒作用,从药物调控宿主抗病毒免疫角度,阐释隐丹参酮抑制病毒复制的分子机制。方法通过流式细胞术、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹实验(Western blotting)等方法检测隐丹参酮对水疱性口炎病毒(VSV)、甲型流感病毒(H1N1)、脑心肌炎病毒(EMCV)、Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响。基于基因集富集分析(GSEA),结合qRT-PCR、流式细胞术,分析隐丹参酮抗病毒的作用机制。在干扰素受体IFNAR1敲除A549细胞(Ifnar1^(-/-)A549)中,检测I型干扰素(IFN-I)通路对隐丹参酮抗病毒功能的影响。结果隐丹参酮显著抑制VSV、H1N1、EMCV和HSV-1病毒的复制,在病毒进入前期和进入后阶段发挥抗病毒作用,对病毒吸附过程无影响;通过GSEA分析结合qRT-PCR验证,证明隐丹参酮促进IFN-I信号通路的激活;在Ifnar1^(-/-)A549细胞中,隐丹参酮的抗病毒功能受到抑制。结论隐丹参酮通过促进IFN-I信号通路激活抑制多种病毒复制。 展开更多

关键词 隐丹参酮 抗病毒 先天免疫 干扰素 干扰素刺激基因 水疱性口炎病毒 甲型流感病毒 脑心肌炎病毒 Ⅰ型单纯疱疹病毒

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表达狂犬病病毒G蛋白嵌合型重组水疱性口炎病毒的构建及鉴定 被引量：1

7

作者 赵婷婷 任秀秀 +6 位作者 王轶男 李实实 黄秋芳 王晓杰 张晓焕 卫江波 苏文浩 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期1450-1454,共5页

目的以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV。方法将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转... 目的以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)为载体,构建表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)G蛋白的嵌合型重组VSV。方法将VSV骨架质粒G基因替换为狂犬病疫苗CTN-1株G基因,与分别表达T7聚合酶及VSV N、P、L蛋白的辅助质粒共转染293T细胞,获得重组病毒。通过RT-PCR、免疫荧光法和Western blot检测RV G基因和G蛋白表达。将重组病毒在Vero细胞上传代培养,检测不同代次病毒滴度并绘制病毒生长曲线。结果成功获得了重组病毒VSV-RVG,RT-PCR结果表明重组病毒基因组中成功插入了RV G基因,免疫荧光法和Western blot可检测到RV G蛋白的表达。重组病毒连续传代5次,病毒滴度稳定在7.5~8.5 lgTCID_(50)/mL之间。结论成功构建了表达RV G蛋白的嵌合型重组VSV,重组病毒具有良好的遗传稳定性,为以VSV为载体的反向遗传学技术平台的构建奠定了基础。 展开更多

关键词 水疱性口炎病毒 狂犬病病毒 反向遗传学 嵌合病毒

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水泡性口炎病毒保护性抗原基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性 被引量：2

8

作者 周学章 李元刚 高丰 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2008年第6期500-503,509,共5页

目的构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测质粒的表... 目的构建水泡性口炎病毒(VSV)保护性抗原基因的重组核酸疫苗质粒,并检测其免疫原性。方法利用RT-PCR从VSV中扩增G蛋白基因,构建重组表达质粒pIRES-G1500,转染BHK-21细胞,以间接免疫荧光、PCR、SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测质粒的表达,用核酸疫苗质粒免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫水平。结果构建的重组核酸疫苗质粒在BHK-21细胞中获得正确表达,质粒免疫小鼠后,可刺激脾细胞、T淋巴细胞亚类数量及CTL杀伤活性显著升高,并可产生高滴度的抗VSV特异性抗体。结论该重组核酸疫苗质粒可作为VSV的候选疫苗。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒 G蛋白 核酸疫苗 免疫原性

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水泡性口炎病毒N蛋白原核表达及免疫原性分析 被引量：1

9

作者 张雪 娄丽 +4 位作者 陈阳 周晓丽 刘钊 贾赟 孙颖杰 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第9期2593-2597,共5页

本研究旨在克隆和表达水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)特异性抗原N蛋白,进而纯化并分析其免疫原性。根据GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV两种不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引... 本研究旨在克隆和表达水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)特异性抗原N蛋白,进而纯化并分析其免疫原性。根据GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV两种不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增获得约1 300bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pColdⅠ原核表达载体中,经IPTG诱导表达后,采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化重组N蛋白。SDS-PAGE分析表明,N基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为50ku;Western blotting检测结果表明,该重组蛋白与VSV多克隆抗体发生特异性反应。本试验成功构建了VSV-IND和VSV-NJ的原核表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒(vsv) N蛋白 原核表达

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干扰素诱导跨膜蛋白3基因敲除Caco2细胞株的构建及其对水泡性口炎病毒复制的影响

10

作者 庞照霞 郝鹏飞 +3 位作者 屈巧巧 李乐天 李昌 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期476-482,共7页

通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序... 通过CRISPR/Cas9系统,旨在构建干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)基因敲除的人结直肠腺癌细胞Caco2,并探究IFITM3基因敲除对水泡性口炎病毒(VSV)复制的影响。针对人IFITM3基因靶向设计sgRNA,合成后连接至pLentiv2载体中获得重组质粒,经测序后将正确连接sgRNA的重组质粒及辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装并感染Caco2细胞,然后进行嘌呤霉素加压筛选,利用有限稀释法获取IFITM3基因敲除单克隆细胞。利用DNA测序和Western blot对所获得单细胞克隆进行鉴定,鉴定正确的细胞命名为Caco2-△IFITM3。用表达绿色荧光蛋白的VSV(VSV-EGFP)感染Caco2-△IFITM3细胞,通过荧光显微镜观察IFITM3敲除对VSV复制的影响。基因组DNA测序结果表明,在IFITM3基因开放阅读框产生了碱基缺失,细胞中IFITM3蛋白表达消失,但细胞活性未受明显影响。病毒感染试验可观察到Caco2-△IFITM3细胞感染比例显著高于Caco2细胞,表明敲除IFITM3使其抗病毒功能减弱。本研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了基于肠道细胞敲除IFITM3基因的Caco2单细胞克隆,验证了IFITM3敲除对细胞抗VSV感染的影响,为进一步深入研究IFITM3与肠道病毒的互作及其功能奠定基础。 展开更多

关键词 干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3) CRISPR/Cas9 Caco2细胞 水泡性口炎病毒(vsv)

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利用VSV标记具有特定投射的特异类型神经元的精细结构 被引量：1

11

作者 文鹏杰 苏鹏 +7 位作者 王浩 胡亮 林坤章 朱续涛 邱宇翔 郑宁 张志建 徐富强 《波谱学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期353-362,共10页

神经元是构成神经系统的基本单位之一,对其精细形态结构的研究是了解神经网络构筑和信息处理方式的基础,然而目前缺乏能够标记具有特定投射特征的特异类型神经元精细结构的有效方法.在糖蛋白基因缺失的水泡性口炎病毒(VSV)毒株基础上突... 神经元是构成神经系统的基本单位之一,对其精细形态结构的研究是了解神经网络构筑和信息处理方式的基础,然而目前缺乏能够标记具有特定投射特征的特异类型神经元精细结构的有效方法.在糖蛋白基因缺失的水泡性口炎病毒(VSV)毒株基础上突变其核蛋白,我们获得了重组病毒VSV-(35)G-NR7A-EGFP,并发现该病毒在一定窗口期内可实现神经元形态的快速高亮度标记;我们进一步在此基础上构建了VSV-(35)G-EnvA-NR7A-EGFP病毒,并基于特定的转基因动物及辅助病毒rAAV-EF1α-Dio-Bfp-Tva,通过控制注射位点,分别实现了有NAc-LH投射特异性的D2R神经元和VTA-NAc投射特异性的多巴胺神经元的标记,展示了一种可用于稀疏、高亮地标记具有特定投射特征的特异类型神经元精细结构的新方法. 展开更多

关键词 稀疏标记 神经元 投射特异性标记 水泡性口炎病毒(vsv)

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水泡性口炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

12

作者 孙晨 王丽 +4 位作者 孙秀萍 苏高莉 潘伟 赵魁 宋德光 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期411-414,共4页

将水泡性口炎病毒(VSV)经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出... 将水泡性口炎病毒(VSV)经差速离心和蔗糖密度梯度离心法进行纯化后,以纯化的VSV作为免疫原免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对制备出的抗VSV单抗的特异性、抗体亚类等生物学特性进行鉴定。结果显示,试验成功筛选出2株能稳定分泌抗VSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C3。ELISA鉴定结果表明,2株单抗均能特异性地与VSV结合,而与口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)均不发生交叉反应;诱生小鼠腹水产生的抗体效价可达1∶25 600～1∶51 200。杂交瘤细胞染色体核型鉴定结果显示,杂交瘤细胞染色体数为95～105,均高于2个亲本细胞的染色体数目,说明这2株细胞是两者的杂交产物。抗体亚类鉴定结果显示,所获得2株单抗1A2、4C3均为IgG1。Western blot分析结果表明,1A2可识别VSV G蛋白。2株抗VSV单克隆抗体的成功制备将为VSV快速检测方法的建立以及检测试剂的研制等奠定基础。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验

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Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响

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作者 孟洁洁 宋月 +6 位作者 樊文杰 杨乐 邢嘉友 王江 褚贝贝 杨国宇 王梦迪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2011-2021,共11页

【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epi... 【目的】探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响。【方法】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epithelial cells,PK15)系。通过构建pTLR7-sgRNA重组质粒并转染至HEK293T/17细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7^(-/-)多克隆细胞,并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7^(-/-)单克隆稳定细胞系。为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功,分别利用光学显微镜和细胞毒性检测(cell counting kit 8,CCK-8)观察并检测PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞的形态与活力;利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后病毒增殖情况;利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况;利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7^(-/-)细胞后子代病毒产生情况。【结果】采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑,其中sgRNA2的基因编辑效率最高,但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力;当感染VSV-GFP后,通过荧光显微镜观察发现,荧光强度随着时间逐次增加,且PK15-TLR7^(-/-)细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞。流式细胞术检测结果显示,相同时间点的PK15-TLR7^(-/-)细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞(P<0.05;P<0.01);实时荧光定量PCR结果表明,感染4~36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加,且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7^(-/-)细胞(P<0.05;P<0.01);Western blotting结果表明,PK15与PK15-TLR7^(-/-)细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达,表达量随时间逐渐增多,且在PK15-TLR7^(-/-)细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高;感染VSV-GFP 6 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 TLR7基因 猪肾上皮细胞(PK15) 水疱性口炎病毒(vsv)

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汉滩病毒包膜糖蛋白假病毒的构建及特性研究

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作者 钟研 李金林 +1 位作者 陈良君 杨占秋 《转化医学电子杂志》 2016年第4期1-5,共5页

目的：研究汉滩病毒包膜糖蛋白与宿主细胞作用的分子机制,构建含有汉滩病毒（HTNV）标准株76-118株包膜糖蛋白的假病毒,并对其进行检测.方法：将表达汉滩病毒包膜糖蛋白的质粒和以VSVΔG为骨架的假病毒颗粒,与293T细胞共转染,构建汉滩... 目的：研究汉滩病毒包膜糖蛋白与宿主细胞作用的分子机制,构建含有汉滩病毒（HTNV）标准株76-118株包膜糖蛋白的假病毒,并对其进行检测.方法：将表达汉滩病毒包膜糖蛋白的质粒和以VSVΔG为骨架的假病毒颗粒,与293T细胞共转染,构建汉滩病毒的假病毒,用中和实验,受体抑制实验,免疫共沉淀和Western Blot对其抗原性、中和反应、受体作用等进行检测.结果：汉滩病毒假病毒与活病毒有相似的抗原特性,汉滩病毒假病毒可以模拟活病毒进入细胞的方式,其糖蛋白是以二聚体形式存在的.结论：成功构建含有汉滩病毒标准株包膜糖蛋白的假病毒,它与活病毒的抗原特性和受体作用的方式相似,这为进一步研究汉滩病毒包膜糖蛋白与宿主细胞作用的分子机制提供了很好的工具. 展开更多

关键词 汉滩病毒 包膜糖蛋白 假病毒 水泡性口炎病毒

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扬子鳄α型干扰素蛋白抗病毒活性分析

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作者 白艺兰 费荣梅 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1420-1425,共6页

为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的... 为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的。将pEGFP-N1-caIFN转染至Vero细胞中,过表达24 h后接种水疱性口炎病毒(VSV),观察细胞,并在VSV感染后第24及48小时收集细胞,通过荧光定量PCR测定病毒VSV-G基因的变化,同时收集上清测定VSV子代病毒滴度,结果表明,与对照组相比,第24及48小时过表达扬子鳄IFN-α的试验组VSV-G基因的表达分别下调4倍及7倍,VSV子代病毒滴度分别低2.3及1.9个数量级。本研究结果证明,真核表达扬子鳄IFN-α蛋白能够抑制VSV mRNA的转录,并能抑制病毒增殖。 展开更多

关键词 IFN-Α 扬子鳄 真核表达 水疱性口炎病毒

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重组水疱性口炎病毒载体病毒包装体系的建立及优化 被引量：3

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作者 卢建博 郑文铝 +3 位作者 余云舟 叶建强 戴秋云 刘珠果 《生物技术通讯》 CAS 2018年第2期183-188,共6页

目的:建立并优化重组水疱性口炎病毒(VSV)载体病毒包装体系,以获得稳定高效的重组VSV载体疫苗包装系统。方法:以prVSVΔG-GFP为骨架载体,pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L为辅助载体,探索不同的骨架质粒及辅助质粒用量、包装细胞系、重组痘病... 目的:建立并优化重组水疱性口炎病毒(VSV)载体病毒包装体系,以获得稳定高效的重组VSV载体疫苗包装系统。方法:以prVSVΔG-GFP为骨架载体,pBS-N、pBS-P、pBS-G、pBS-L为辅助载体,探索不同的骨架质粒及辅助质粒用量、包装细胞系、重组痘病毒vTF7-3作用时间、转染试剂作用时间等因素对重组VSV载体病毒包装的影响,用光学显微镜及荧光显微镜观测重组VSV载体病毒的包装效果,应用TCID50法测定重组VSV的滴度。结果:重组VSV的包装效率随着辅助质粒或包装质粒总量的减少而降低,293T细胞较BHK21-WI2细胞包装效率更高,适当延长重组痘病毒vTF7-3作用时间或转染试剂作用时间能提高VSV包装效率。优化的病毒包装条件为:选用293T细胞,v TF7-3以5～15 MOI感染细胞1 h或以5 MOI感染细胞1～4 h,总质粒用量为3.67～22μg,转染细胞6～14 h可获得高效包装的rVSVΔG-GFP。采用优化包装条件高效包装了rVSVΔG-ZE病毒。结论:获得了稳定高效的重组VSV包装体系,为重组VSV载体的疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 重组水疱性口炎病毒载体 包装体系 寨卡病毒 优化

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减毒水泡性口炎病毒诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡及其作用机制 被引量：3

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作者 连海 张静敏 +3 位作者 夏志平 汤晶 张爽 于玲 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期264-269,共6页

目的:研究减毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的机制。方法:将减毒VSV以1.0 MOI的接种密度感染HeLa细胞,在6、12、18、24和30 h后收集细胞,MTT法检测HeLa细胞的增殖;AO/E... 目的:研究减毒水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)对宫颈癌HeLa细胞的凋亡诱导作用,并探讨其可能的机制。方法:将减毒VSV以1.0 MOI的接种密度感染HeLa细胞,在6、12、18、24和30 h后收集细胞,MTT法检测HeLa细胞的增殖;AO/EB染色观察HeLa细胞凋亡形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测HeLa细胞早期凋亡率,流式细胞术分析HeLa细胞sub-G1凋亡峰,JC-1染色法测定细胞线粒体跨膜电位水平,caspase试剂盒检测HeLa细胞caspase-3、caspase-8及caspase-9的活性。结果:减毒VSV感染HeLa细胞12和24 h后,HeLa细胞增殖活力分别为(78.4±1.9)%和(63.1±5.6)%(P<0.01);早期凋亡细胞率分别为(16.88±2.48)%和(31.9±4.24)%(P<0.01),sub-G1凋亡峰分别为(14.85±1.48)%和(21.05±2.28)%(P<0.01)。随着减毒VSV感染时间的增加,HeLa细胞线粒体跨膜电位逐渐降低(P<0.05),caspase-9和caspase-3的活性显著升高(均P<0.05)。结论:减毒VSV能够抑制HeLa细胞的增殖,并通过caspase-9和caspase-3依赖的途径诱导HeLa细胞凋亡。 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒 宫颈肿瘤 HeLa细胞 凋亡

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肿瘤坏死因子的抗病毒作用研究

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作者 贾凤兰 贾克明 +1 位作者 肖雷 吴旻 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1990年第5期328-331,共4页

报道肿瘤坏死因子(TNF)在体外对流感病毒、人滤泡性口腔炎病毒有明显的抗感染作用。TNF与流感病毒(A_3/雅防87-2,H_3N_2)同时加入狗肾传代细胞,48h后,病毒对照组细胞出现明显的病变,细胞病变(CPE)可达(?),而实验组(病毒加TNF),细胞未出... 报道肿瘤坏死因子(TNF)在体外对流感病毒、人滤泡性口腔炎病毒有明显的抗感染作用。TNF与流感病毒(A_3/雅防87-2,H_3N_2)同时加入狗肾传代细胞,48h后,病毒对照组细胞出现明显的病变,细胞病变(CPE)可达(?),而实验组(病毒加TNF),细胞未出现病变,生长良好,经活性染料染色测OD值,对照组与实验组之间,活存细胞百分数有明显差异。TNF对疱疹性口腔炎病毒(VSV)的抗感染作用,无论先加入、同时加入或后加入TNF,均表现出明显的保护作用,使人羊膜传代细胞免遭VSV病毒损害。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子 抗病毒作用

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SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测水泡性口炎病毒方法的建立 被引量：2

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作者 李嘉阳 赵佳男 +3 位作者 秦彤 季芳 李刚 王承民 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期152-161,共10页

本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建... 本研究旨在建立一种快速、灵敏的用于诊断水泡性口炎的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。通过RT-PCR分别扩增印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSVNJ)的G基因,然后将其连接到克隆载体pMD19-T上,构建质粒标准品pMD-VSV-IN-G和pMD-VSV-NJG。根据GenBank中VSV-IN和VSV-NJ的G基因保守序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ法进行实时荧光定量RT-PCR,建立标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果,在拷贝数6.82~6.82×10^(8)copies/μL范围内,C;值与质粒拷贝数的对数值呈良好的线性关系,pMD-VSV-IN-G标准曲线的R;值为0.99812,p MD-VSV-NJ-G标准曲线的R^(2)值为0.99748;检测其他病毒均无特异性扩增曲线,特异性良好。pMD-VSVIN-G的检测灵敏度为6.82 copies/μL,pMD-VSV-NJ-G的检测灵敏度也为6.82 copies/μL,是普通RTPCR方法的10倍。用该方法对实验室保存的VSV-IN和VSV-NJ各5份攻毒小鼠样品进行检测,检测结果与普通RT-PCR检测一致。上述结果表明,本检测方法的建立对快速、灵敏鉴别诊断IN型和NJ型水泡性口炎病毒具有重要的应用价值。 展开更多

关键词 印第安纳型水泡性口炎病毒(vsv-IN) 新泽西型水泡性口炎病毒(vsv-NJ) RT-PCR 实时荧光定量PCR SYBR GreenⅠ

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