肠道病毒71型血清学检测方法的建立及应用 被引量：8

1

作者 马洪滨 侯俊 +7 位作者 李鲁平 杨静 郭静霞 刘爱霞 徐军 聂为民 李伯安 毛远丽 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期239-240,共2页

目的在原核表达系统中对肠道病毒71型(EV71)基因进行克隆、表达、纯化,建立血清IgM抗体的检测方法,用于EV71感染的早期诊断。方法检索EV71 VP1基因序列,设计合成引物,并在引物两端插入酶切位点,采用RT-PCR分离EV71 VP1全基因序列。PCR... 目的在原核表达系统中对肠道病毒71型(EV71)基因进行克隆、表达、纯化,建立血清IgM抗体的检测方法,用于EV71感染的早期诊断。方法检索EV71 VP1基因序列,设计合成引物,并在引物两端插入酶切位点,采用RT-PCR分离EV71 VP1全基因序列。PCR产物回收、纯化,插入T载体进行序列同源性测定。再插入表达质粒载体pRSET,构建pRSET-EV71重组质粒。利用纯化后的表达产物,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测EV71IgM抗体。共收集31例临床诊断为手足口病患儿及36例健康儿童的血清标本进行检测。结果PCR产物片段大小约890bp,与预期VP1全基因序列长度一致,并且克隆入T载体后序列测定与GenBank公布序列的同源性达100%;重组蛋白大小约为890bp,与预期蛋白片段一致。ELISA检测结果显示,在手足口病患儿中IgM抗体阳性7例,健康儿童中则未发现阳性,差异有统计学意义。结论成功建立了针对EV71IgM抗体的检测方法。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 基因 vp1 酶联免疫吸附测定

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广西猪细小病毒6型VP1基因序列进化分析 被引量：3

2

作者 尹柏双 赵翠青 +2 位作者 刘立明 沙万里 李国江 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第4期70-73,共4页

为研究广西地区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株流行,分析PPV6毒株遗传进化和分子特征,采用PCR技术对广西地区采集的猪组织样品进行PPV6基因片段检测。结果表明,广西地区猪群存在PPV6,感染率为36%(27/75),同时也存在着PPV6与猪圆环病毒... 为研究广西地区是否存在猪细小病毒6型(PPV6)毒株流行,分析PPV6毒株遗传进化和分子特征,采用PCR技术对广西地区采集的猪组织样品进行PPV6基因片段检测。结果表明,广西地区猪群存在PPV6,感染率为36%(27/75),同时也存在着PPV6与猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染现象,感染率为32%;5株PPV6 VP1基因与中国参考株TJ株、韩国参考株KSU1-AZ-2014株、美国参考株U18-4株、波兰参考株P15-1株核苷酸序列同源性分别为99.3%～99.8%,99.3%～99.8%,98.9%～99.8%,99.3%～99.8%;VP1基因遗传进化分析表明,PPV6包含两个基因亚群,5株PPV6与中国参考株BJ、SC、JS、TJ株及波兰参考株处在G2亚群,而美国U18-4株则单独处于一个G1亚群。本研究为中国PPV6毒株流行病学及其病毒致病性研究提供研究基础。 展开更多

关键词 猪细小病毒6型 vp1基因 遗传进化 广西

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肠道病毒71型VP1及2A基因特征研究 被引量：2

3

作者 范张洁 段广才 +1 位作者 张卫东 郗园林 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期234-240,共7页

目的 检测临床分离的肠道病毒71型（EV71）轻型、重型毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列,进行遗传进化途径分析.方法 将50份临床手足口病患者粪便标本处理后分离病毒,用EV71特异性引物进行RT-PCR扩增,获得EV71毒株,针对不同临床背景的标... 目的 检测临床分离的肠道病毒71型（EV71）轻型、重型毒株VP1基因、2A基因的核苷酸序列,进行遗传进化途径分析.方法 将50份临床手足口病患者粪便标本处理后分离病毒,用EV71特异性引物进行RT-PCR扩增,获得EV71毒株,针对不同临床背景的标本,分别选取轻型、重型的毒株,用特异性引物分别对VP1基因及2A基因进行RT-PCR扩增,对其产物进行测序及遗传进化分析,并探讨它们之间的差别.结果 50份临床手足口病标本中有30份检测是EV71,其中轻型（手足口）13份,重型（手足口并发脑炎或心肌炎）17份.轻型和重型中各自选取5株对VP1基因和2A基因进行测序和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此10株EV71病毒和中国大陆已发表的5株EV71病毒（fuyangEU703814.1、xi_anHM003207.1、shandongEU753418.1、shenzhen-FJ607337.1、henanGU366191.1）全部属于C基因型,且核苷酸同源性较高,VP1基因和2A基因的同源性分别在94.7%～99.4%和93.6%～99.3%范围内.本次分离的10株EV71病毒与A、B基因型代表株比较,核苷酸同源性分别为81.0%～84.6%和78.4%～82.2%,差异较大.与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,核苷酸同源性在87.8%～90.2%,差异≥10%,与已知的C4亚型代表株比较,核苷酸同源性在96.8%～99.6%,因此认为可将这10株病毒划分为C4亚型.在系统发生树上,这10株病毒形成一个较独立的分支.结论 EV71 C4亚型病毒在中国大陆有较广泛的传播,且毒株之间VP1基因的遗传关系紧密;2A基因在轻型和重型病例毒株之间遗传差异不大. 展开更多

关键词 肠道病毒71型 基因型 vp1基因 2A基因 遗传进化

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人微小病毒B19 VP1基因原核表达克隆的构建

4

作者 于红 张文卿 +2 位作者 王斌 丁守怡 王海青 《青岛大学医学院学报》 CAS 2002年第2期117-120,共4页

①目的　构建人微小病毒B19VP1基因的原核高效表达系统。②方法　通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因 ,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX 4T 2上 ,IPTG诱导表达融合蛋白 ,产物经亲和层析初步纯化 ,以Western Blot进行鉴定 ,... ①目的　构建人微小病毒B19VP1基因的原核高效表达系统。②方法　通过PCR扩增B19病毒主要抗原决定簇VP1区段基因 ,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX 4T 2上 ,IPTG诱导表达融合蛋白 ,产物经亲和层析初步纯化 ,以Western Blot进行鉴定 ,并包被ELISA板 ,对临床血清进行检测。③结果　pGEX 4T 2 VP1可在大肠杆菌中高效表达 ,表达产物经纯化后可得单一目的蛋白条带。ELISA结果表明 ,其灵敏度、特异度等指标与德国Virion试剂盒有较好的符合率。④结论　该重组蛋白具有良好的抗原性 。 展开更多

关键词 细小病毒B19 人 基因 vp1 原核表达

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2012-2013年昆明和曲靖两地肠道病毒71型VP1基因分析 被引量：1

5

作者 周晓芳 尹洁 +2 位作者 寸建萍 姜黎黎 徐闻 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第5期368-373,共6页

目的分析2012-2013年间,云南省昆明、曲靖两地区手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患者中肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)的基因特征。方法对收集的病例粪便样本进行病毒分离培养和real-time RT-PCR鉴定,并对鉴定为EV-A7... 目的分析2012-2013年间,云南省昆明、曲靖两地区手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)患者中肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)的基因特征。方法对收集的病例粪便样本进行病毒分离培养和real-time RT-PCR鉴定,并对鉴定为EV-A71型的毒株进行VP1区的核酸序列测定,构建遗传进化树进行基因型别分析。结果两地两年间共收集了538份样本,其中EV-A71型分离株105份,105份EV-A71型分离株均属于C4a亚型,105株EV-A71型分离株在遗传进化树明显聚集为三簇,提示在两地存在多种病毒传播链的可能。结论 2012-2013年昆明、曲靖两地由EV-A71引起的手足口病均属C4a亚型,但其存在多条传播链的流行趋势。 展开更多

关键词 肠道病毒71型 手足口病 vp1基因

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江浙沪地区EV71的分子流行病学特征 被引量：1

6

作者 王磊 崔大伟 +5 位作者 戴玉柱 徐莉 杨先知 谢国良 郑书发 陈瑜 《中华医院感染学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第19期4321-4324,共4页

目的研究江浙沪地区EV71-VP1遗传变异特征,了解江浙沪地区EV71病毒基因突变及抗原变异规律,为EV71的预防、治疗提供帮助。方法从GenBank上下载了江浙沪地区2009-2014年共79株EV71的VP1区段序列与各亚型参考株序列,用MEGA7.0软件构建进化... 目的研究江浙沪地区EV71-VP1遗传变异特征,了解江浙沪地区EV71病毒基因突变及抗原变异规律,为EV71的预防、治疗提供帮助。方法从GenBank上下载了江浙沪地区2009-2014年共79株EV71的VP1区段序列与各亚型参考株序列,用MEGA7.0软件构建进化树,分析江浙沪地区EV71-VP1分子流行病学特征;用疫苗株FY23株做为参考株比较江浙沪地区EV71毒株的氨基酸变异情况。结果通过进化树与序列同源分析,发现79株毒株均为C4a亚型,江浙沪地区EV71毒株可分为两个大簇与数个小簇,两个大簇间没有发现明显的序列差异,江浙沪三个地区的毒株在进化树上的分布不存在明显的差异。79株毒株共存在34个氨基酸位点突变,其中与病毒致病及疫苗接种效果相关的98、145、289位点发生多株突变,7株发生了病毒与受体结合相关的E145G/Q突变,7株发生了位于病毒表面BC环内的E98K突变,5株发生了与临床症状表现相关的A289T/V突变,未发现2009-2014年有明显的EV71毒株氨基酸变异差异。结论虽然2009-2014年江浙沪地区的EV71毒株流行亚型没有改变,也不存在明显地区间的流行差异,但是病毒的基因及氨基酸突变较为多见,仍应关注该地区的病毒基因及抗原变异,以便更好的预防EV71疫情。 展开更多

关键词 EV71 C4亚型 vp1基因 进化树 突变

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柯萨奇B1病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达

7

作者 赵铁强 钟照华 +5 位作者 田野 韩福生 梁瑛娟 谷淑燕 皮国华 孟繁超 《中国地方病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期5-7,共3页

目的　在大肠杆菌中表达柯萨奇 B1(CVB1)病毒 VP1蛋白。方法　用限制性酶切方法将 CVB1VP1基因从 p MD18-T-VP1上切下 ,连接至 p QE3 0构建原核表达系统 p QE3 0 -VP1。经酶切和 PCR验证后转化至大肠杆菌 BL2 1(DE3 ) ,用 IPTG诱导目的... 目的　在大肠杆菌中表达柯萨奇 B1(CVB1)病毒 VP1蛋白。方法　用限制性酶切方法将 CVB1VP1基因从 p MD18-T-VP1上切下 ,连接至 p QE3 0构建原核表达系统 p QE3 0 -VP1。经酶切和 PCR验证后转化至大肠杆菌 BL2 1(DE3 ) ,用 IPTG诱导目的基因表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western-blot检测 VP1蛋白的表达。结果　酶切、PCR证明构建的原核表达系统携带方向正确的 CVB1VP1基因。SDS-PAGE和 Western-blot实验均可于 3 3 .0 k Da处见到目的条带。结论　 展开更多

关键词 柯萨奇病毒B 大肠杆菌 原核表达 vp1基因

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感染中枢神经系统肠道病毒的分子生物学分型 被引量：3

8

作者 李鹏 郭华 陈宗波 《齐鲁医学杂志》 2008年第4期319-320,322,共3页

目的探讨小儿肠道病毒(EV)中枢神经系统感染病毒基因VP1序列的分子分型的临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,应用通用引物和VP1段分子分型引物检测77例临床诊断为无菌性脑膜炎病儿(其中急性期63例,恢复期14例)脑脊液(C... 目的探讨小儿肠道病毒(EV)中枢神经系统感染病毒基因VP1序列的分子分型的临床意义。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,应用通用引物和VP1段分子分型引物检测77例临床诊断为无菌性脑膜炎病儿(其中急性期63例,恢复期14例)脑脊液(CSF)的EV RNA,并对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究。结果77例无菌性脑膜炎病儿CSF中,采用通用引物经两次PCR在急性期共获得阳性结果47例(占急性期的74.6%),恢复期3例(占恢复期的21.4%)。将EV RNA阳性的50例标本应用分型引物经两次PCR共获得阳性结果31例(占62.0%)。随机抽取27条阳性片段进行克隆测序,测序结果通过BLAST软件与GenBank EV标准毒株进行同源性对比分析,相关序列同源性均在97%以上。结论采用分型引物扩增VP1部分序列并测序,将EV的VP1部分序列与GenBank中的EV标准毒株进行对比,根据基因序列的同源性可以对EV进行型别鉴定,为EV的分型研究提供了新的方法和思路。 展开更多

关键词 肠道病毒感染 逆转录聚合酶链反应 vp1核酸序列 基因 病毒

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鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达 被引量：1

9

作者 鄢明华 赵晓岩 +5 位作者 刘长军 王笑梅 王端 李刚 秦运安 邓国华 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期426-429,共4页

将鸡传染性贫血病毒M990 5株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中 ,然后转化到DH10BAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组 ,最后将重组子转染Sf9昆虫细胞 ,得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组... 将鸡传染性贫血病毒M990 5株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中 ,然后转化到DH10BAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组 ,最后将重组子转染Sf9昆虫细胞 ,得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1_2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中 ;SDS_PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。 展开更多

关键词 鸡传染性贫血病毒 vp1、vp2基因 重组杆状病毒

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玉米穗发芽突变体vp⁃like8的转录组分析 被引量：1

10

作者 郭宇航 郑军 李润植 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2020年第3期98-109,共12页

[目的]玉米穗发芽严重影响作物产量与品质,本研究通过分析玉米穗发芽突变体(viviparous)vp⁃like8与野生型在转录水平上的差异,探索玉米穗发芽相关基因调控网络,深入解析玉米穗发芽发生的分子机制。[方法]对本实验室发现的玉米穗发芽突变... [目的]玉米穗发芽严重影响作物产量与品质,本研究通过分析玉米穗发芽突变体(viviparous)vp⁃like8与野生型在转录水平上的差异,探索玉米穗发芽相关基因调控网络,深入解析玉米穗发芽发生的分子机制。[方法]对本实验室发现的玉米穗发芽突变体vp⁃like8的杂合体分别与自交系Mo17和Zheng58杂交,然后再自交,随机选取具有穗发芽表型的F2果穗,发芽籽粒和正常籽粒各取40粒,剥除种皮,分别混池Mo17背景的突变体(Mo17_mut)和野生型(Mo17_wt),Zheng58背景的突变体(Zheng58_mut)和野生型(Zheng58_wt)等4份试验样品,利用转录组测序技术(RNA⁃Seq),借助生物信息学手段,对野生型和突变体进行比较转录组分析。[结果]在vp⁃like8突变体中,共筛选到2750个差异表达基因,其中1812个基因在突变体中上调表达,938个下调表达。GO(Gene ontology)功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析发现,差异基因主要富集在代谢途径(Metabolic pathways)、光合作用(Photosynthesis)、植物激素信号转导(Plant hormone signal transduction)等生物途径,由此推测这些途径与玉米穗发芽是紧密相关的。[结论]本研究可为今后探究玉米穗发芽的分子机制和基因调控网络提供重要的数据支持。 展开更多

关键词 玉米 穗发芽 vp⁃like8 vp1 RNA⁃Seq 差异表达基因

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持续感染口蹄疫病毒VP1蛋白对细胞转录组的影响

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作者 杨黎 刘萍 +7 位作者 韦美华 柯雄锋 刘丽清 宋静静 方莹 唐欢 孔令保 辛秀 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期411-421,共11页

【目的】通过转录组测序(RNA-Seq)方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15... 【目的】通过转录组测序(RNA-Seq)方法分析持续感染口蹄疫病毒结构蛋白VP1诱导的PK-15细胞基因表达谱的变化,探索VP1蛋白对宿主细胞信号通路的影响。为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。【方法】PK-15细胞分别转染pCAGGS-HA(对照载体)、pCAGGS-HA-Pi-VP1质粒,转染36 h后,Western blot检测VP1蛋白表达,同时提取两组细胞总RNA进行转录组测序(每组3个重复,2组6个样本)。将测序所得的序列进行过滤比对,获得差异表达基因后,对差异表达基因进行了生物信息学分析。采用qRT-PCR验证关键差异表达基因的表达。【结果】RNA-Seq共鉴定出3376个差异表达基因(DEGs)|log2(Fold Change)|>0和padj<0.05,其中上调基因1744个,下调基因1632个。许多参与免疫反应和炎症的效应基因差异表达。GO和KEGG富集分析显示,差异基因GO条目绝大部分与核糖体有关,而KEGG富集中涉及了与天然免疫相关的信号通路,如TNF信号通路、Toll受体信号通路。【结论】pCAGGS-HA-Pi-VP1转染PK-15细胞之后,改变了细胞的表达谱,获得的DEGs及其功能注释信息有助于理解其对宿主细胞的影响,为后续开展VP1影响FMDV持续感染相关机制研究提供基础数据和理论支持。 展开更多

关键词 转录组 基因表达谱 FMDV 持续感染 vp1 差异表达基因

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