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靶向敲除棉花GhAGL16高效sgRNA的筛选
1
作者 雷建峰 尤扬子 +5 位作者 张锦恩 代培红 于莉 杜正阳 李月 刘晓东 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1023-1033,共11页
【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子,在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术(virus-induced gene editing,VIGE)筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs,并验证这些sgRNAs的特异性... 【目的】AGL16是棉花MADS-box基因家族中一个重要的转录负调控因子,在抵御干旱和盐胁迫过程中发挥着重要作用。利用病毒介导的基因编辑技术(virus-induced gene editing,VIGE)筛选靶向敲除棉花GhAGL16的sgRNAs,并验证这些sgRNAs的特异性,为定向创制棉花agl16突变体奠定重要基础。【方法】根据在棉花YZ-1中A亚组和D亚组上实际克隆GhAGL16的基因组序列,预测了3个能靶向敲除GhAGL16的sgRNAs;基于棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus,CLCrV)介导的VIGE系统,构建3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体;利用qPCR检测Cas9超表达(Cas9 over-expression,Cas9-OE)植株中Cas9的表达量,确定Cas9是否稳定遗传表达;将3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体分别转化Cas9-OE棉花子叶,并通过PCR/RE方法检测3个靶点的突变情况;利用生物信息学方法分析3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构;对突变植株进行Hi-TOM高通量测序,明确基因编辑效率。同时,对转化GhAGL16-sgRNA2的突变植株进行脱靶率鉴定,检测基因编辑的特异性。【结果】成功构建了3个能同时靶向敲除GhAGL16-A亚组和GhAGL16-D亚组序列的sgRNAs。对不同Cas9-OE植株中Cas9表达量检测结果表明,Cas9在不同Cas9-OE棉株中稳定表达。用3个CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNAs表达载体转化Cas9-OE棉花子叶,PCR/RE突变检测结果表明,GhAGL16-sgRNA2可有效用于GhAGL16的靶向敲除,在棉花A亚组和D亚组靶位点上出现了不同碱基缺失的突变类型,而GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3是2个无效sgRNA。3个GhAGL16-sgRNAs的二级结构分析结果表明,GhAGL16-sgRNA1和GhAGL16-sgRNA3可能存在引导序列容易与其他序列发生配对并且不易解链的现象,干扰了引导序列对目标位点的识别,导致sgRNA无效。进一步量化GhAGL16-sgRNA2对GhAGL16的编辑效率,对每一株转化CLCrV-AtU6-26::GhAGL16-sgRNA2的Cas9-OE植株突变检测结果表明,在转化的9株Cas9-OE植株中有6株发生了突变,突变效� 展开更多
关键词 棉花 GhAGL16 sgRNA 突变体 vige 脱靶
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CLCrV介导的VIGE体系承载力的研究 被引量：3
2
作者 赵燚 雷建峰 +5 位作者 刘敏 胡子曜 代培红 刘超 李月 刘晓东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期210-219,共10页
探索CLCrV介导的VIGE体系的承载力。通过CLCrV介导的sgRNA投送系统将基因编辑载体注射过表达Cas9的棉花,提取棉花基因组DNA,利用PCR/RE的方法筛选有效的sgRNA。然后利用同样的方法来检测CLCrV介导的VIGE体系的承载力。基于棉花GhBsr-k1... 探索CLCrV介导的VIGE体系的承载力。通过CLCrV介导的sgRNA投送系统将基因编辑载体注射过表达Cas9的棉花,提取棉花基因组DNA,利用PCR/RE的方法筛选有效的sgRNA。然后利用同样的方法来检测CLCrV介导的VIGE体系的承载力。基于棉花GhBsr-k1基因成功构建了6个基因编辑载体,其中2个基因编辑载体实现了对棉花GhBsr-k1基因的靶向编辑;将完整的基因编辑载体元件构建到CLCrV病毒载体上并没有检测到棉花细胞中发生基因编辑。针对棉花GhBsr-k1基因,筛选到两个有效的sgRNA。但承载整个CRISPR/Cas9系统的CLCrV载体难以在棉花叶片中实现有效的基因编辑。 展开更多
关键词 棉花叶皱缩病毒 vige 棉花 GhBsr-k1
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拟南芥agl16突变体的创制及功能鉴定 被引量：1
3
作者 尤扬子 刘晓东 +3 位作者 曲延英 赵帅 帕热哈·艾海提 雷建峰 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期1801-1808,共8页
AGL16是调控拟南芥气孔密度和ABA含量的重要负调控转录因子,在拟南芥抗旱反应过程中发挥重要的作用。为了获取拟南芥agl16突变体材料,采用棉花叶皱缩病毒(CLCrV)介导的VIGE系统筛选靶向敲除拟南芥AGL 16的sgRNA,同时利用农杆菌介导的浸... AGL16是调控拟南芥气孔密度和ABA含量的重要负调控转录因子,在拟南芥抗旱反应过程中发挥重要的作用。为了获取拟南芥agl16突变体材料,采用棉花叶皱缩病毒(CLCrV)介导的VIGE系统筛选靶向敲除拟南芥AGL 16的sgRNA,同时利用农杆菌介导的浸花法将完整编辑载体转化野生型拟南芥,创制了拟南芥agl16突变体并进行抗旱性鉴定。结果表明:(1)利用CLCrV介导的VIGE系统筛选获得2个能靶向敲除AGL 16基因的sgRNA,同时构建AtU6-26∷AtAGL 16-sgRNA1-35S∷Cas9-Ter-p1300编辑载体转化野生型拟南芥Col-0,筛选获得靶位点缺失4 bp的agl16纯合突变体(AGL 16:-4)。(2)抗旱表型性鉴定结果显示,干旱处理18 d后,大部分野生型植株干枯死亡,而突变体植株受胁迫的表型相对较轻;复水后,野生型和突变体植株的存活率分别为34.5%(10/29)和75%(27/36)。(3)与野生型相比,干旱胁迫下AGL 16:-4纯合突变体植株叶片单位面积气孔数量减少、离体叶片失水率显著降低,但二者的单株种子量并没有发生明显的改变。研究认为,AGL 16:-4纯合突变体的抗旱性较野生型明显增强,且种子量与野生型基本一致,表明AGL 16基因可作为作物抗旱育种理想的候选靶基因;所获得的agl16突变体为后期从农作物中克隆的AGL 16同源基因进行功能回补验证提供了有利的转基因受体材料。 展开更多
关键词 拟南芥 vige AGL16 突变体 抗旱性
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基于Csy4与MCP的新型迷你基因组编辑系统的构建
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作者 邓嘉辉 雷建峰 +6 位作者 赵燚 刘敏 胡子曜 尤扬子 邵武奎 柳建飞 刘晓东 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期68-79,共12页
MCP是MS2噬菌体的外壳蛋白,Csy4是一种参与CRISPR 1-F系统crRNA生成的小型蛋白,能够以较高的特异性识别并结合RNA。目前CRISPR/Cas等基因组编辑技术存在靶向核酸酶分子量大、脱靶率高、受PAM位点限制等问题,为解决上述问题,构建基于上... MCP是MS2噬菌体的外壳蛋白,Csy4是一种参与CRISPR 1-F系统crRNA生成的小型蛋白,能够以较高的特异性识别并结合RNA。目前CRISPR/Cas等基因组编辑技术存在靶向核酸酶分子量大、脱靶率高、受PAM位点限制等问题,为解决上述问题,构建基于上述两种小型蛋白的新型迷你基因组编辑系统。本研究采用AlphaFold2预测MCP-FokI、FokI-MCP、Csy4-FokI和FokI-Csy4融合蛋白的结构,通过浸花法将MCP-FokI和FokI-MCP编辑载体分别转化拟南芥,利用拟南芥叶片注射的方法投送CLCrV介导的Csy4-FokI与FokI-Csy4编辑系统,提取拟南芥基因组DNA,通过HI-TOM高通量测序检测新型迷你基因组编辑系统的编辑能力。结果显示,融合蛋白中MCP、FokI和Csy4都各自保持着自身原有的三维结构,预示它们都能正常发挥彼此的功能。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的4个不同中间间隔区的双靶位点MCP-FokI和MCP-FokI植物表达载体,初步证明MCP-FokI和FokI-MCP均不能实现对靶基因的靶向编辑。构建靶向敲除拟南芥CLA1基因的7个CLCrV介导的不同中间间隔区的双靶位点Csy4-FokI编辑载体,其中CLCrV介导的Csy4-FokI编辑系统能够实现对靶基因的靶向编辑,但是突变类型均为碱基置换类型且编辑效率很低,而FokI-Csy4基因组编辑体系并未检测到编辑的发生。成功构建了Csy4-FokI新型迷你基因组编辑系统,为克服CRISPR/Cas基因组编辑技术存在的问题提供了一种新的解决方案。 展开更多
关键词 Csy4 MCP 棉花叶皱缩病毒 vige 拟南芥
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棉花中不同植物病毒介导的VIGE体系的研究
5
作者 雷建峰 李月 +6 位作者 代培红 赵燚 尤扬子 贾建国 赵帅 曲延英 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期978-987,共10页
植物病毒介导sgRNA的传递与表达相比传统转化完整的编辑载体进行基因编辑具有巨大优势,因为sgRNA的表达可以伴随着病毒的复制和移动而快速扩增、累积,从而产生高效的基因编辑效率。为在棉花中开发应用更多植物病毒介导的基因编辑系统(vi... 植物病毒介导sgRNA的传递与表达相比传统转化完整的编辑载体进行基因编辑具有巨大优势,因为sgRNA的表达可以伴随着病毒的复制和移动而快速扩增、累积,从而产生高效的基因编辑效率。为在棉花中开发应用更多植物病毒介导的基因编辑系统(virus-induced genome editing,VIGE)。本研究以超表达Cas9(Cas9-OE)棉花作为VIGE受体,在棉花中分别建立了棉花叶皱缩病毒(cotton leaf crumple virus,CLCrV)和烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)介导的VIGE系统。首先CLCrV和TRV介导的VIGE均可以靶向敲除棉花GhBsrk1和GhMAPKKK2基因A亚组和D亚组基因组序列,验证了这2个系统的可行性和有效性。进一步量化这2个系统对GhBsrk1和GhMAPKKK2基因的编辑效率结果发现,CLCrV和TRV介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率,并且2种系统基因编辑效率不存在显著差异。本研究还探究了使用棉花内源U6启动子和拟南芥U6启动子驱动sgRNA对VIGE基因编辑效率的影响。结果显示,这2个启动子介导的VIGE均能够产生高效的基因编辑效率,并且基于这2种启动子介导的VIGE系统基因编辑效率不存在显著差异。以上结果预示着可以开发更多的植物病毒载体应用于棉花基因编辑的研究,进而获得高效的sgRNA筛选体系。 展开更多
关键词 棉花 CLCrV TRV vige 基因编辑
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