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VEGF189基因合成、原核表达及鉴定 被引量：4
1
作者 陈丹 王宏 +4 位作者 朱中松 向军俭 杨琴 赵鑫 邓宁 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期469-472,共4页
目的获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白。方法应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经... 目的获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白。方法应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经HisTrapTMHP亲和柱层析纯化,测定蛋白浓度。结果DNA测序分析表明,合成的VEGF189基因与文献报道相一致。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的Trx-VEGF189融合蛋白,以包涵体和可溶2种形式存在。表达产物可被兔抗鼠VEGF多抗特异识别。经HisTrapTMHP亲和柱纯化,获得纯度达85%的融合蛋白。结论成功合成VEGF189基因,并在原核表达系统中获得高表达,为研制高效抗肿瘤的VEGF抗体和疫苗奠定了前期基础。 展开更多
关键词 vegf189 SOEPCR 原核表达
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人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性 被引量：1
2
作者 贾恩朝 夏文娇 +2 位作者 路臣桂 张会勇 朱武凌 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期346-350,共5页
目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K... 目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189(vascular endothelial growth factor 189,VEGF189),并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 人血管内皮生长因子189 毕氏酵母 纯化 血管通透性试验 生物学活性
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重组VEGF-A_(189)发酵、纯化及鉴定
3
作者 朱中松 王宏 +4 位作者 杨琴 向军俭 赵鑫 杨红宇 邓宁 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期560-565,共6页
为了获得大量重组血管内皮生长因子(VEGF-A189)蛋白的可溶性表达,对重组VEGF-A189工程菌进行发酵条件的优化并开展发酵研究.通过摇瓶培养进行可溶性发酵条件优化,在5L发酵罐中发酵重组VEGF-A189工程菌,将发酵产物经镍离子柱亲和层析纯化... 为了获得大量重组血管内皮生长因子(VEGF-A189)蛋白的可溶性表达,对重组VEGF-A189工程菌进行发酵条件的优化并开展发酵研究.通过摇瓶培养进行可溶性发酵条件优化,在5L发酵罐中发酵重组VEGF-A189工程菌,将发酵产物经镍离子柱亲和层析纯化,并对发酵产物进行SDS-PAGE,WesternBlot和ELISA等分析鉴定.结果表明,重组VEGF-A189工程菌可溶性发酵条件为:37℃培养重组VEGF-A189工程菌4h,加入0.3mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于28℃诱导表达4h.在5L发酵罐中按比例放大发酵,在补料发酵3.5h后菌体密度(A600nm)达到8.0,调整发酵温度到28℃,IPTG诱导4h后的菌体密度为13.72,菌体产量为40g/L.镍离子柱亲合层析纯化后重组VEGF-A189纯度达到90%以上,回收率大于80%,WesternBlot、ELISA分析结果显示,重组VEGF-A189蛋白和抗VEGF抗体有良好的结合活性.结果表明经过发酵条件优化后发酵可获得有免疫结合活性的可溶性重组VEGF-A189蛋白. 展开更多
关键词 血管内皮生长因子(vegf-A189) 发酵 可溶表达 亲和层析
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