目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因...目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。展开更多
目的通过电融合法制备肝癌候选标志物人vasorin(VASN)蛋白单克隆抗体并进行鉴定。方法以人带组氨酸标签的VASN重组蛋白(VASN-His)免疫小鼠后进行细胞电融合,间接ELISA筛选能够结合天然VASN的阳性克隆。通过ELISA检测抗体的效价及亲和力...目的通过电融合法制备肝癌候选标志物人vasorin(VASN)蛋白单克隆抗体并进行鉴定。方法以人带组氨酸标签的VASN重组蛋白(VASN-His)免疫小鼠后进行细胞电融合,间接ELISA筛选能够结合天然VASN的阳性克隆。通过ELISA检测抗体的效价及亲和力、Western blot法检测抗体能否识别HepG2细胞中VASN蛋白。结果在脾细胞与Sp2/0细胞的比例为2∶1,交变电场场强50 V 2 MHz 20 s,直流脉冲强度500 V 0.5 s时,融合率达0.31%。获得2株小鼠抗人VASN单克隆抗体(4H1和8B9),抗体最高效价为1∶256000,亲和力最高可达到4.9×10^(6)L/mol;2株抗体均可识别HepG2细胞的VASN蛋白。结论运用细胞电融合法成功制备2株小鼠抗人VASN的单克隆抗体。展开更多
文摘目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。
文摘目的通过电融合法制备肝癌候选标志物人vasorin(VASN)蛋白单克隆抗体并进行鉴定。方法以人带组氨酸标签的VASN重组蛋白(VASN-His)免疫小鼠后进行细胞电融合,间接ELISA筛选能够结合天然VASN的阳性克隆。通过ELISA检测抗体的效价及亲和力、Western blot法检测抗体能否识别HepG2细胞中VASN蛋白。结果在脾细胞与Sp2/0细胞的比例为2∶1,交变电场场强50 V 2 MHz 20 s,直流脉冲强度500 V 0.5 s时,融合率达0.31%。获得2株小鼠抗人VASN单克隆抗体(4H1和8B9),抗体最高效价为1∶256000,亲和力最高可达到4.9×10^(6)L/mol;2株抗体均可识别HepG2细胞的VASN蛋白。结论运用细胞电融合法成功制备2株小鼠抗人VASN的单克隆抗体。
