口蹄疫病毒O/China/99株多基因植物组成型表达载体的构建及序列分析 被引量：4

1

作者 潘丽 张永光 +8 位作者 王永录 王宝琴 王文秀 方玉珍 蒋守田 张维德 董金杰 吕建亮 谢庆阁 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第10期841-844,905,共5页

目的构建包含FMDV结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B的基因片段P12X3C的植物组成型表达载体,为FMDV可饲疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增法,从pGEM/P12A质粒和pGEM/3C质粒中扩增P12A及部分2B基因(P12X)、3C基因,将获得的P12X... 目的构建包含FMDV结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B的基因片段P12X3C的植物组成型表达载体,为FMDV可饲疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增法,从pGEM/P12A质粒和pGEM/3C质粒中扩增P12A及部分2B基因(P12X)、3C基因,将获得的P12X与3C片段经BamHI/SpeI和SpeI/SalI双酶切后,与经BamHI/SalI双酶切后的pUC18质粒大片段连接,得到重组质粒pUC18/P12X3C,pUC18/P12X3C质粒经BamHI/SalI双酶切后的大片段与经同样双酶切的植物表达载体pBin438连接,转化子经酶切、PCR及测序鉴定后,获得包含FMDV O/China/99株P12X3C片段的植物组成型表达载体pBin438/P12X3C,最后通过三亲交配法,将表达载体pBin438/P12X3C导入农杆菌。结论成功构建FMDV多基因的植物组成型表达载体。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 O/China/99株 多基因植物 组成型表达载体 基因序列 可饲疫苗

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FMDV结构基因P1的克隆与植物双元表达载体的构建 被引量：3

2

作者 王宝琴 张永光 +3 位作者 王小龙 潘丽 王文秀 王永录 《畜牧与兽医》 北大核心 2005年第9期3-5,共3页

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV... 通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构基因P1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将P1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pB in438,构建重组中间表达载体pB inP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pB inFMDV-P1。结果表明:P1基因为2 208 bp。重组中间表达载体pB inP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明P1基因、Kozak序列等已插入pB inP1。在含50mg/L卡那霉素、25 mg/L链霉素和50 mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行P1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pB inFMDV-P1构建正确。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 P1基因 克隆 三亲融合 双元表达载体 根癌农杆菌

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α-淀粉酶基因在肠膜明串珠菌基因表达中的应用 被引量：3

3

作者 田云飞 刘晓莉 +1 位作者 成文玉 金红星 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期203-207,共5页

目的:为了验证α-amy(α-淀粉酶基因)在肠膜明串珠菌中应用的可行性,构建重组质粒并建立了肠膜明串珠菌的三亲杂交体系。方法:以大肠杆菌-明串珠菌的穿梭载体p CW4为基础,构建了携带α-amy标记的重组质粒p CW7。肠膜明串珠菌ATCC8293(Le... 目的:为了验证α-amy(α-淀粉酶基因)在肠膜明串珠菌中应用的可行性,构建重组质粒并建立了肠膜明串珠菌的三亲杂交体系。方法:以大肠杆菌-明串珠菌的穿梭载体p CW4为基础,构建了携带α-amy标记的重组质粒p CW7。肠膜明串珠菌ATCC8293(Leuconostoc mesenteroides)的g6ph(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)表达盒插入到p CW7,并通过三亲杂交转化肠膜明串珠菌而获得重组菌株。结果:重组菌株的甘露醇产量比原始菌株提高了7%。三亲杂交中可以通过α-amy标记筛选重组子。结论:证实了α-amy标记在肠膜明串珠菌中应用的可行性。 展开更多

关键词 肠膜明串珠菌 Α-淀粉酶基因 三亲杂交 6-磷酸葡萄糖脱氢酶

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甲基营养菌MB200中mutL基因的突变及高耐甲醇菌株的筛选 被引量：2

4

作者 闻东明 黄罗冬 +1 位作者 杨青山 申佩弘 《工业微生物》 CAS 2020年第4期15-20,共6页

甲基营养菌M.sp.MB200是本实验室保存的一株可以利用甲醇为碳源的甲基营养菌,具有利用甲醇作为底物生产L-丝氨酸的能力。提高其耐底物浓度的能力,有利于L-丝氨酸的转化。以M.sp.MB200野生菌株作为出发菌株,通过三亲本结合进行同源单交... 甲基营养菌M.sp.MB200是本实验室保存的一株可以利用甲醇为碳源的甲基营养菌,具有利用甲醇作为底物生产L-丝氨酸的能力。提高其耐底物浓度的能力,有利于L-丝氨酸的转化。以M.sp.MB200野生菌株作为出发菌株,通过三亲本结合进行同源单交换构建突变修复基因mutL插入突变菌株MB200mTB,该突变株无法修复菌体在繁殖传代过程中产生的各种随机突变,以甲醇为碳源进行环境压力筛选,具有甲醇耐受突变的菌株可以在甲醇浓度不断升高的环境中生长,而其余突变方向菌株在高甲醇环境下不能生长,进而筛选出甲醇耐受方向的突变株。对耐高浓度甲醇的菌株使用三亲本结合回补mut L基因,得到了7株可以在甲醇浓度为7%的基础培养基中生长性状优异的突变株。在含7%甲醇的基础培养基中,MB200mHB1号突变株较出发菌株M.sp.MB200甲醇耐受性提升近4倍,菌体生长量增加2.2倍。 展开更多

关键词 M.sp MB200 mutL插入突变 甲醇耐受 三亲本结合

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根瘤菌吸氢基因种间转移的研究

5

作者 王振宇 郭晓芳 +1 位作者 王海磊 刘国生 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第14期4128-4129,共2页

通过三亲本杂交将花生根瘤菌吸氢基因的重组质粒pZ55(Tcr)转入野生型的大豆、绿豆等根瘤菌菌株(Hup-、Apr),研究结果表明,在自生条件下,诱导大豆和绿豆根瘤菌吸氢活性的表达,实现了花生根瘤菌吸氢基因的种间转移。在豌豆和四季豆根瘤菌... 通过三亲本杂交将花生根瘤菌吸氢基因的重组质粒pZ55(Tcr)转入野生型的大豆、绿豆等根瘤菌菌株(Hup-、Apr),研究结果表明,在自生条件下,诱导大豆和绿豆根瘤菌吸氢活性的表达,实现了花生根瘤菌吸氢基因的种间转移。在豌豆和四季豆根瘤菌中却不能表达吸氢活性,提示外源吸氢基因的表达受到受体菌株的调控。 展开更多

关键词 根瘤菌 转吸氢基因 三亲本杂交

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瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选 被引量：1

6

作者 李晓霞 马俊义 +4 位作者 魏娜 胡白石 李晓娟 杨小丽 安仙丽 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期1036-1041,共6页

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株。挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行S... 利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株。挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应。瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础。 展开更多

关键词 瓜类细菌性果斑病菌 Mini-Tn5转座子 三亲杂交 群体感应 信号分子

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苜蓿花叶病毒RNA_23′端cDNA转基因烟草的研究

7

作者 李颖 哈斯阿古拉 +1 位作者 方天祺 张鹤龄 《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》 CAS 2004年第4期440-443,共4页

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKII中,用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404,采用叶圆片法转化普通烟草,诱导再生小植株.经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明AlMVRNA23... 将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV-Ch)RNA23′端cDNA重组到植物表达载体pROKII中,用三亲融合法导入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404,采用叶圆片法转化普通烟草,诱导再生小植株.经卡那霉素抗性筛选和PCR检测,证明AlMVRNA23′端基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中. 展开更多

关键词 转基因烟草 苜蓿花叶病毒 植株 中国分离株 农杆菌 PCR检测 卡那霉素抗性 RNA DNA重组 植物表达载体

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抗药性根瘤菌基因工程菌的构建与应用

8

作者 林创 马庆生 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 1990年第3期29-32,共4页

用三亲本杂交的方法将外源抗药性质粒导入到高效固氮的根瘤菌 Tal377中,外源质粒在 Tal377中能正常表达,但不影响其原有的固氮结瘤能力。利用此抗药性根瘤菌所携带的抗药性,在接种此根瘤菌的同时结合施加一定浓度的抗菌素,抗药性根瘤菌... 用三亲本杂交的方法将外源抗药性质粒导入到高效固氮的根瘤菌 Tal377中,外源质粒在 Tal377中能正常表达,但不影响其原有的固氮结瘤能力。利用此抗药性根瘤菌所携带的抗药性,在接种此根瘤菌的同时结合施加一定浓度的抗菌素,抗药性根瘤菌与出发菌株相比表现出一定程度地提高其结瘤固氮能力和占瘤率。 展开更多

关键词 三亲本杂交 结瘤固氮 占瘤率 慢生型大豆根瘤茵

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根瘤菌HH103 Ⅲ型效应因子编码基因的突变方法改进

9

作者 付营 辛大伟 +10 位作者 刘洋 王锦辉 李长育 刘丽敏 于仁敬 尹燕斌 谷月 邱海阳 王雅楠 刘春燕 陈庆山 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期1719-1724,共6页

突变基因的编码序列是研究基因功能的一个有效途径。三亲杂交是利用细菌结合的特性使外源DNA进入受体细胞,通过外源DNA与基因组目标序列发生同源重组,进而实现突变目标基因的有效方法。本研究通过分析同源臂的长度和混合菌比例,明确其... 突变基因的编码序列是研究基因功能的一个有效途径。三亲杂交是利用细菌结合的特性使外源DNA进入受体细胞,通过外源DNA与基因组目标序列发生同源重组,进而实现突变目标基因的有效方法。本研究通过分析同源臂的长度和混合菌比例,明确其对三亲杂交效率的影响。以根瘤菌HH103的芋型效应因子编码基因nop B、nop C、nop L为例,对混合菌(根瘤菌,帮助菌株,供体菌株)的比例和同源臂的长度设置了不同的梯度组合,探讨根瘤菌Ⅲ型效应因子突变的高效方法。结果显示,左右同源臂的长度为521 bp、861 bp时和三种菌混合的比例为2:1:1的因素组合,是突变目标基因最高效的组合方法。本研究所改进方法可为根瘤菌及其它革兰氏阴性菌的基因高效突变研究提供参考。 展开更多

关键词 根瘤菌HH103 Ⅲ型效应因子编码基因 三亲杂交 同源臂长度 混合菌比例

原文传递

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

10

作者 时韶磊 林红 +4 位作者 舒正玉 刘艳如 李欣 武海龙 黄建忠 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期123-129,共7页

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderi... Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。 展开更多

关键词 伯克霍尔德菌ZYB002 脂肪酶LipA 细胞结合脂肪酶 基因敲除 三亲本杂交

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口蹄疫病毒vp1基因的克隆与植物双元表达载体的构建

11

作者 王宝琴 王小龙 +2 位作者 张永光 潘丽 王文秀 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期166-169,共4页

通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构蛋白基因vp1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438,构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinF... 通过RT-PCR法获得阿克苏(Akesu/O/58)FMDV结构蛋白基因vp1,将该基因克隆到pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。将vp1基因、Kozak序列等插入中间表达质粒pBin438,构建重组中间表达载体pBinVP1。采用三亲融合法构建植物双元表达载体pBinFMDV-VP1。结果表明:vp1基因为639bp。重组中间表达载体pBinVP1经BamHⅠ/SalⅠ双酶切、PCR扩增和序列测定,表明vp1基因、Kozak序列等插入pBinVP1中。在含50mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和50mg/L利福平的YEB培养基上筛选及对融合农杆菌质粒进行vp1基因的PCR检测,证明植物双元表达载体pBinFMDV-VP1构建正确。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 克隆 三亲融合 双元表达载体 根癌农杆菌

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黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的植物表达载体构建 被引量：1

12

作者 张兰英 梁玉玲 张丽平 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期10-13,共4页

目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体。方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上。BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1 301,回收... 目的:构建除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶的植物表达载体。方法:通过PCR从重组质粒pGWB2/Cjhppd中扩增出大小为1 300bp的目的片段,亚克隆到pGEM-T easy上。BamHⅠ和SpeⅠ双酶切pGEM-T Easy/Cjhppd和质粒pCambia1 301,回收得到1 300bp的Cjhppd基因片段和开环质粒pCambia-1301-UbiN,用T4连接酶连接,得到重组质粒,利用三亲法将其导入农杆菌EHA105中。结果:成功得到农杆菌EHA105的阳性菌落,菌落PCR扩增得到和预期大小一致的1300bpDNA片段。结论:成功将具有除草剂抗性的Cjhppd构建到了含有玉米泛素启动子Ubi和选择性标记基因Hpt的植物表达载体pCambia-1301-UbiN/Cjhppd,并导入根癌农杆菌EHA105中,可以用于水稻等单子叶植物的遗传转化。 展开更多

关键词 黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因 植物表达载体 三亲法 除草剂 维生素E

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沈抚灌区广宿主石油烃代谢质粒的分离及鉴定 被引量：1

13

作者 王亚菲 李慧 李小彬 《应用生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期3289-3299,共11页

本研究采用"三亲配对外源分离法",从沈抚灌区土壤、底泥和水样中共计分离得到8个广宿主(BHR)石油烃代谢质粒,并通过对其进行抗生素抗性检测和抗性遗传标记,将其转移至大肠杆菌(Escherichia coli)EC100宿主中进行操作.不相容... 本研究采用"三亲配对外源分离法",从沈抚灌区土壤、底泥和水样中共计分离得到8个广宿主(BHR)石油烃代谢质粒,并通过对其进行抗生素抗性检测和抗性遗传标记,将其转移至大肠杆菌(Escherichia coli)EC100宿主中进行操作.不相容性群分析结果表明:pS3-2C、pS4-6G为Inc P质粒;pS3-2G、pW22-3G、pA15-7G为Inc N质粒;pS7-2G为Inc W质粒;pA23-1G和pA10-1C为Inc Q质粒.采用PCR扩增已报道的石油烃污染物降解基因的方法初步分析其石油烃代谢功能,质粒pS3-2G、pS7-2G、pA23-1G、pW22-3G和pA10-1C上含有编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)和甲苯单加氧酶基因(touA)的片段;pA15-7G含有编码甲苯双加氧酶和甲苯单加氧酶基因片段;pS3-2C含有编码芳香环羟化双加氧酶、苯双加氧酶和甲苯双加氧酶基因片段;pS4-6G仅含有编码芳香环羟化双加氧酶基因片段.通过宿主范围检测,除质粒pS3-2C外,其余7个质粒均可在变形菌纲(Proteobacteria)α-、β-、γ-亚纲的代表性菌株根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228、大肠杆菌EC100间进行转移并稳定传代. 展开更多

关键词 水平基因转移 三亲配对外源质粒分离 广宿主质粒 石油烃降解 生物修复

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含Gus基因的工程质粒转化马铃薯细胞

14

作者 应燕如 叶建江 +2 位作者 杨金水 葛扣麟 汪训明 《复旦学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 1992年第3期350-354,共5页

应用“三亲株杂交”法,将含有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ基因)和β-葡糖苷酸酶(Gus)基因的双向质粒pBI121转移到根癌农杆菌LBA4404(内含mini-Ti质粒中),得到由mini-Ti质粒和pBI121组成的双元载体系统(LBA4404/pBI121).用类似叶盘转化的茎... 应用“三亲株杂交”法,将含有卡那霉素抗性基因(NPT-Ⅱ基因)和β-葡糖苷酸酶(Gus)基因的双向质粒pBI121转移到根癌农杆菌LBA4404(内含mini-Ti质粒中),得到由mini-Ti质粒和pBI121组成的双元载体系统(LBA4404/pBI121).用类似叶盘转化的茎盘转化法,将农杆菌LBA4404*pBI121感染马铃薯无菌苗茎段.通过选择培养基筛选,获得具有K_M^R表型的愈伤组织,且能分化成芽.经Gus和NPT-Ⅱ分析,表明外源基因已在抗性愈伤组织和再生芽中表达. 展开更多

关键词 根癌土壤农杆菌 质粒 转化 马铃薯 GUS基因 NPT-Ⅱ基因 三亲株杂交法

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