猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：4

1

作者 周红蕾 程淑琴 +3 位作者 李佳鹏 刘涵 姚志兰 张蕾 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期130-138,共9页

旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因... 旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从32份猫临床样品中检测出FHV-1阳性11份、FCV阳性21份、Bb阳性4份,并经PCR测序验证。本研究初步建立了FHV-1、FCV、Bb多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高的特点,为临床猫上呼吸道疾病病原的分子检测提供参考。 展开更多

关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 猫杯状病毒 支气管败血波氏杆菌 taqman荧光定量pcr

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检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立 被引量：6

2

作者 刘俊平 庄金山 +3 位作者 孙志 张建武 陶琦 袁世山 《上海交通大学学报（农业科学版）》 2007年第5期483-488,共6页

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度... 针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 taqman 荧光pcr 检测

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乙型流感病毒TaqMan荧光定量PCR分型检测方法的建立及初步应用

3

作者 赵文欣 朱翔宇 +6 位作者 肖妍 韩继成 哈卓 张赫 谢宇飚 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期685-691,共7页

通过比对GISAID登录的乙型流感病毒Victoria谱系、Yamagata谱系HA基因序列,选择保守区域设计并合成1对引物及2条荧光探针,以实验室保存的乙型流感毒株RNA为模板分别扩增Victoria谱系和Yamagata谱系HA基因片段,构建重组质粒标准品pUC57-... 通过比对GISAID登录的乙型流感病毒Victoria谱系、Yamagata谱系HA基因序列,选择保守区域设计并合成1对引物及2条荧光探针,以实验室保存的乙型流感毒株RNA为模板分别扩增Victoria谱系和Yamagata谱系HA基因片段,构建重组质粒标准品pUC57-Vic和pUC57-Yama,经PCR及测序鉴定正确后作为质粒标准品,初步建立乙型流感病毒的TaqMan荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分型检测方法。结果显示,该方法可以特异的鉴别检测乙型流感Victoria谱系、Yamagata谱系病毒RNA,对甲型流感病毒、EB病毒、腺病毒等RNA/DNA的检测结果均为阴性;对重组质粒标准品的检测限分别为333、2940拷贝/μL;批内与批间的重复性试验的变异系数均小于2%,表明所建立的检测方法特异性良好、灵敏度较高、重复性好;利用该方法与常规反转录PCR(RT-PCR)方法对10份流感样病例咽拭子进行检测,检测结果一致(3/10)。结果表明,本试验建立的乙型流感病毒TaqMan荧光定量PCR分型检测方法能够检测乙型流感病毒,为乙型流感病毒Victoria谱系及Yamagata谱系的鉴别提供更加快速准确的定量检测手段。 展开更多

关键词 乙型流感病毒 taqman荧光定量pcr 血凝素

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猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：4

4

作者 马琳 付薇 +6 位作者 何奇松 徐贤坤 易春华 孙翔翔 蒋家霞 黄胜斌 熊毅 《广西农业科学》 CAS CSCD 2010年第11期1223-1225,共3页

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒(CSFV)TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异... 根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒(CSFV)TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 taqman荧光定量pcr taqman探针

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氯化镉诱发16HBE细胞系恶性转化过程中TIF3 p36的变化 被引量：5

5

作者 魏莲 雷毅雄 +1 位作者 王敏 胡兵 《中华劳动卫生职业病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期578-581,共4页

目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子(TIF3)p36mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以及敏感先进的Taqman荧光定... 目的探讨氯化镉诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段蛋白翻译起始因子(TIF3)p36mRNA表达水平的变化,为进一步阐明氯化镉的分子致癌机制提供线索。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以及敏感先进的Taqman荧光定量PCR方法,检测并分析氯化镉诱发16HBE恶性转化不同阶段即转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞的TIF3 p36 mRNA表达量的变化。结果相对于非转化对照细胞(16HBE),氯化镉诱发恶性转化不同阶段细胞(转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞)的TIF3 p36 mRNA基因表达水平均明显升高(P＜0．01或P＜0．05),其中低剂量组(5μmol/L)所转化的各阶段细胞的eIF3 p36 mRNA平均表达量分别是对照细胞的3．1、5．9和9．9倍,中剂量组(10μmol/L)的各阶段转化细胞的TIF3平均表达量分别是对照细胞的7．1、6．8和14．8倍,高剂量组(15μmol/L)的各阶段转化细胞的TIF3 p36平均表达量分别是对照细胞的3．6、3．0和9．1倍。这些不同剂量组的研究结果提示,eIF3 p36的异常表达量与氯化镉诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系,但与镉的剂量无关。结论氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的蛋白翻译启动因子eIF3 p36异常表达现象,其表达水平与细胞的恶变程度密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一。 展开更多

关键词 氯化镉 人支气管上皮细胞 恶性转化 翻译起始因子TIF3 P36 taqman荧光定量pcr

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基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立 被引量：1

6

作者 祝秀梅 马全英 +3 位作者 杜平 王凡 吕志慧 牟克斌 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期579-582,596,共5页

目的建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30... 目的建立一种能检测猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法根据PRRSV的ORF7基因保守区的核苷酸序列设计引物和TaqMan探针,通过探针浓度的优化,建立检测PRRSV的TaqMan探针荧光定量PCR方法。用该方法对30份临床疑似病料进行检测,并与常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行比较。结果 TaqMan荧光PCR检测PRRSV的最佳探针浓度为0.4μmol,检测灵敏度可达3.51拷贝/μL。检测的30份样品与病毒分离结果的符合率为100%,与普通PCR的检测结果(25/30)比较,本方法对临床样品的检出率(28/30)更高。结论建立的方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样品的检测。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 taqman荧光定量pcr

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氯化镉诱发16HBE细胞恶变过程中TEF-1δ p31异常表达的研究

7

作者 魏莲 雷毅雄 +2 位作者 王敏 李敏 邹晓妮 《癌变．畸变．突变》 CAS CSCD 2007年第4期267-271,共5页

背景与目的:探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段人翻译延伸因子TEF-1δ p31 mRNA表达的变化,以进一步阐明CdCl2致癌的分子机制。材料与方法:应用RT与PCR技术,以及Taqman荧光定量PCR方法,检测不同浓度C... 背景与目的:探讨氯化镉(CdCl2)诱发人支气管上皮细胞(16HBE)恶性转化过程中不同阶段人翻译延伸因子TEF-1δ p31 mRNA表达的变化,以进一步阐明CdCl2致癌的分子机制。材料与方法:应用RT与PCR技术,以及Taqman荧光定量PCR方法,检测不同浓度CdCl2诱发16HBE恶性转化3个不同阶段细胞(转化期间细胞、转化细胞和成瘤细胞)的TEF-1δ p31 mRNA表达量的变化。结果:①相对于非转化16HBE对照细胞,CdCl2诱发恶性转化3个不同阶段细胞的TEF-1δ mRNA表达水平均显著升高(P<0.01或P<0.05),5μmol/L CdCl2处理组各阶段细胞内的TEF-1δ平均表达量分别是对照细胞的3.4、5.2和6.9倍;10μmol/L CdCl2处理组各阶段细胞内的TEF-1δ平均表达量分别是对照细胞的4.1、6.9和6.3倍;15μmol/L CdCl2处理组各阶段转化细胞内的TEF-1δ平均表达量分别是对照细胞的1.4、2.9和8.4倍。提示TEF-1δ的异常表达量与CdCl2诱发16HBE细胞恶变程度之间有正相关关系(r>0.799,P<0.01)。②16HBE细胞恶变不同阶段TEF-1δp31的异常表达水平与CdCl2的剂量相关(P=0.001)。结论:氯化镉在诱发16HBE细胞恶变过程中,存在明显的人翻译延伸因子TEF-1δ p31异常表达的现象,其表达水平与细胞恶性转化程度和CdCl2的剂量密切相关,这可能是氯化镉诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机制之一。 展开更多

关键词 氯化镉(CdCl2) 人支气管上皮细胞(16HBE) 恶性转化 翻译延伸因子TEF-1δ p31 荧光定量pcr

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猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用 被引量：9

8

作者 秦毅斌 何苹萍 +7 位作者 卢冰霞 韦嫔媛 何颖 李斌 苏乾莲 段群棚 周英宁 赵武 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期692-699,共8页

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒（PDCoV）N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特... 根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒（PDCoV）N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10 9-2.2×10 1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X＋38.95,线性相关系数（R2）为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度（2.2×10 2、2.2×10 4、2.2×10 6copies/L）的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 荧光定量RT-pcr taqman探针

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猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：2

9

作者 郝立沙 张璐 +5 位作者 佟杰 于颖 杨莹莹 张武超 涂亚斌 蔡雪辉 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第6期168-171,共4页

为了快速准确检测猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）并对病毒拷贝数进行定量,试验根据Gen Bank中PCV-2保守序列（登录号为FJ644559.1）设计1对特异性引物和Taq Man探针,制备标准品,建立PCV-2的荧光定量检测方法,并对临床样品进行检测。结果表明... 为了快速准确检测猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）并对病毒拷贝数进行定量,试验根据Gen Bank中PCV-2保守序列（登录号为FJ644559.1）设计1对特异性引物和Taq Man探针,制备标准品,建立PCV-2的荧光定量检测方法,并对临床样品进行检测。结果表明：该方法在1×10^1~1×10^8拷贝/μL的模板范围内具有良好的线性关系,相关系数可达0.999;敏感性是常规PCR方法的100倍;对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）均为阴性,没有交叉反应;批内、批间重复试验变异系数均小于2.50%;在临床检测中,比常规PCR方法检测PCV-2的阳性检出率高出38%。说明试验成功建立了PCV-2 Taq Man荧光定量PCR检测方法,可用于临床检测PCV-2感染及对其拷贝数进行定量。 展开更多

关键词 猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2) taqman荧光定量pcr 应用 探针 标准品 拷贝数

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猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用 被引量：1

10

作者 秦毅斌 苏乾莲 +8 位作者 赵硕 卢冰霞 何颖 周展宏 袁婷婷 李斌 段群棚 欧阳康 赵武 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第11期37-42,46,共7页

为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果... 为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为阳性标准品,通过优化反应条件,建立了检测PTV的RT-qPCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,该方法仅对PTV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与4.6×10^(8)~4.6×10_(2)拷贝/μL的质粒浓度范围具有良好线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.201×log X+40.527,线性相关系数(R^(2))为0.996,检测下限为4.6×10^(1)拷贝/μL。对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于4.0%,具有良好的重现性。应用所建立的方法对235份临床猪腹泻样品进行检测,PTV阳性样品32份,样品阳性率为13.62%。本试验建立的RT-qPCR方法为PTV实验室检测及病毒研究分析提供了可靠的技术手段。 展开更多

关键词 猪捷申病毒 荧光定量RT-pcr taqman探针

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猪链球菌9型荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：12

11

作者 拜廷阳 杨增岐 +3 位作者 吴志明 普志平 赵明军 闫若潜 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2008年第1期7-12,共6页

【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复... 【目的】建立猪链球菌9型(SS9)的快速诊断和定量分析方法。【方法】根据GenBank已登录的SS9cps9H基因保守部分序列设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了SS9的TaqMan荧光定量PCR检测方法(Taq-Man FQ-PCR),并进行了敏感性、特异性和重复性试验;利用所建立的检测方法对河南省11例疑似猪链球菌临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了对比。【结果】成功建立了SS9的FQ-PCR检测方法和定量标准曲线,FQ-PCR方法的检测灵敏度可达1.0拷贝/μL,特异性高且重复性良好;利用该方法对11份临床疑似猪链球菌感染组织病料进行的应用检测表明,其中有3份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。【结论】成功建立的SS9 FQ-PCR诊断方法,可用于临床SS9型病菌感染的快速诊断及样品中细菌含量的定量分析。 展开更多

关键词 猪链球菌9型 荧光定量pcr taqman荧光探针 检测方法

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猪巨细胞病毒TaqMan荧光定量PCR检测的建立 被引量：6

12

作者 拜廷阳 赵德明 +4 位作者 吴志明 闫若潜 刘淑敏 赵明军 刘梅芬 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期169-174,共6页

目的建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的Taq... 目的建立一种特异、灵敏、快速检测猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。方法根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine Cytomegalovirus,PCMV)DNA序列设计合成特异性引物对和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了猪巨细胞病毒的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR),进行了FQPCR检测方法的敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PCMV感染临床样品进行了应用检测,并与常规PCR方法进行了比对;对FQ-PCR检测结果为PCMV阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测。结果成功建立了PCMV的FQ-PCR方法,标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;检测灵敏度可达1拷贝/μL,是常规PCR的100倍;特异性高,对pGEM-T/PCMV重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对6个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/PCMV重组质粒分别重复扩增6次,重复结果良好;对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行应用检测表明,其中有9份样品为阳性,与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。猪的内脏器管中PCMV含量最高为扁桃体,最低的为小肠。结论成功建立了PCMV FQ-PCR方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测,对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。 展开更多

关键词 猪巨细胞病毒 实时荧光定量pcr taqman荧光探针 检测 应用

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