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结核分支杆菌Ag85B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究 被引量：22
1
作者 范雄林 徐志凯 +3 位作者 李元 薛莹 李别虎 白光春 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第9期548-550,共3页
目的　构建编码结核分支杆菌 (MTB)Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒 ,并研究其免疫原性。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分支杆菌H3 7Ra 基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因 ,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后 ,与同样酶消化的pcDNA3... 目的　构建编码结核分支杆菌 (MTB)Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒 ,并研究其免疫原性。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分支杆菌H3 7Ra 基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因 ,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后 ,与同样酶消化的pcDNA3连接 ,转化大肠杆菌JM10 9,阳性克隆用酶切鉴定 ;重组表达质粒肌注免疫小鼠 4周后 ,分别用dotblotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度。结果　酶切鉴定重组表达质粒pTB30s构建成功 ;dotblotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性 ,ELISA检测抗体几何平均滴度为 1∶12 0。结论　应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答 ,以用于结核病 (TB) 展开更多
关键词 结核分支杆菌 基因疫苗 免疫原性 85B抗原 结核 免疫
原文传递
结核新疫苗研究进展 被引量：14
2
作者 李洱花 梁张 +1 位作者 宝福凯 柳爱华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2015年第1期69-74,共6页
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种人畜共患传染病。近年来随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株(MDR)的增多和艾滋病的流行,结核病死灰复燃,如何有效控制和预防结核病的发生显得尤为重要。卡介苗(BCG)仍是目前人类普遍使用的抗结核疫苗... 结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种人畜共患传染病。近年来随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株(MDR)的增多和艾滋病的流行,结核病死灰复燃,如何有效控制和预防结核病的发生显得尤为重要。卡介苗(BCG)仍是目前人类普遍使用的抗结核疫苗,但其免疫预防效果不甚理想,因此研究新型结核疫苗迫在眉睫,本文就近年来抗结核新疫苗研究的最新进展作一综述。 展开更多
关键词 结核病 抗结核疫苗 卡介苗 亚单位疫苗 dna疫苗 综述
原文传递
人IL-12与结核分枝杆菌抗原ESAT-6联合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：10
3
作者 郝牧 鲍朗 高蕾 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期477-481,共5页
人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcI... 人白细胞介素12（IL-12）与结核分枝杆菌免疫优势抗原ESAT-6真核表达质粒联合基因免疫,诱导免疫应答效果观察.近交系BALB/c小鼠,随机分组：A组（生理盐水对照）、B组（pcDNA3.1空质粒对照）、C组（BCG对照）、D组（pcESAT-6）和E组（pcIL-12＋pcESAT-6）.B、D、E质粒免疫组小鼠分别于胫前肌肌肉注射布比卡因（7.5g/L）和质粒的混和物（1：4,100μL,含质粒70μg/次）,A组小鼠肌肉注射生理盐水和布比卡因的混和物（1：4,100μL）,均间隔2周免疫一次,共免疫3次;末次免疫时,C组小鼠皮下注射BCG菌液,0.3mL/只,含10^6CFU/mL.末次免疫后14d和28d,各组小鼠分别取血分离血清用于总IgG测定,同时分离脾细胞,经TB-PPD刺激后检测脾细胞增殖（XTT比色法）活性和脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分泌水平.pcESAT-6质粒DNA单独免疫（D组）或与pcIL-12质粒DNA联合免疫（E组）,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且抗体水平在末次加强免疫后14～28d逐渐增加;但pcIL-12与pcESAT-6联合免疫后,特异性抗体水平较pcESAT-6单独免疫增加不明显（P＜0.05）.c、D、E组免疫小鼠脾细胞体外经TB-PPD刺激后,E组小鼠特异性淋巴细胞增殖活性和IFN-γ分泌水平明显强于C组和D组（P＜0.05）,而IL-4分泌水平相互间未发现明显差异.末次加强免疫后14～28d,E组小鼠脾细胞增殖活性维持在较高水平,而C组小鼠脾细胞增殖活性先低后高,D组则先高后低;IFN-γ诱生水平,E组最高,C组次之,D组最低.pcIL-12与pcESAT-6质粒DNA联合免疫后能刺激机体产生强烈的细胞免疫和稳定的体液免疫,在动物体内诱发的细胞免疫较ESAT-6或BCG单独免疫时均有明显增加并维持较长时间,此外联合免疫后诱导的体液免疫也较BCG免疫有明显增加. 展开更多
关键词 白细胞介素12 结核分枝杆菌 ESAT-6 dna疫苗
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结核杆菌保护性抗原-遍在蛋白质系统的建立 被引量：10
4
作者 王庆敏 胡振林 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期61-63,共3页
目的 :将结核杆菌 4种保护性抗原基因与小鼠遍在蛋白质 (泛素 )基因融合 ,建立抗原 -遍在蛋白质系统。方法 :通过RT- PCR技术从小鼠睾丸组织中克隆遍在蛋白质 c DNA,同时培养结核杆菌并从基因组中克隆出 4种保护性抗原编码区 ,然后通过... 目的 :将结核杆菌 4种保护性抗原基因与小鼠遍在蛋白质 (泛素 )基因融合 ,建立抗原 -遍在蛋白质系统。方法 :通过RT- PCR技术从小鼠睾丸组织中克隆遍在蛋白质 c DNA,同时培养结核杆菌并从基因组中克隆出 4种保护性抗原编码区 ,然后通过柔性接头将遍在蛋白质与 4种抗原的基因分别融合在一起 ,并插入到 p VAX质粒中。结果 :扩增出来的 4种抗原基因大小分别约为 0 .3、0 .7、1.0、1.6 5 kb,遍在蛋白质 PCR产物约为 0 .2 kb,均与 Gen Bank中登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果显示融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序显示抗原基因和遍在蛋白质基因均为所需基因 ,柔性接头序列也完全正确。 结论 :成功地构建了中国株结核杆菌的 4种保护性抗原基因 -遍在蛋白质融合系统 。 展开更多
关键词 结核杆菌 遍在蛋白质 dna疫苗 结核病
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结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究 被引量：8
5
作者 范雄林 徐志凯 +5 位作者 李元 李别虎 薛莹 柏银兰 白光春 贾向志 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期90-92,共3页
目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱... 目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B 基因疫苗 免疫保护作用
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结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究 被引量：8
6
作者 谢勇恩 《川北医学院学报》 CAS 2007年第1期7-10,共4页
目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建... 目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。 展开更多
关键词 结核杆菌 多价核酸疫苗 免疫原性
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结核分枝杆菌esat-6基因疫苗的构建和免疫原性的研究 被引量：7
7
作者 王丽梅 范雄林 +4 位作者 师长宏 李元 柏银兰 薛莹 徐志凯 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第5期369-370,378,共3页
目的　构建以结核分枝杆菌H3 7Rvesat - 6基因为基础的基因疫苗 ,并研究其免疫原性。方法　采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切含有esat- 6目的基因的质粒pGEM -Teasy -esat6 ,10 g L-1琼脂糖凝胶电泳回收约 30 0bp大小片段 ,以亚克隆法构建于真... 目的　构建以结核分枝杆菌H3 7Rvesat - 6基因为基础的基因疫苗 ,并研究其免疫原性。方法　采用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切含有esat- 6目的基因的质粒pGEM -Teasy -esat6 ,10 g L-1琼脂糖凝胶电泳回收约 30 0bp大小片段 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3 1的相应酶切位点阳性克隆经酶切鉴定证实。重组表达质粒肌注免疫BALB/c小鼠三次 ,每次间隔 2周 ,ELISA检测小鼠血清中产生抗体的水平。结果　用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定证实目的基因正确插入载体 ,命名为pcDE6 ,重组质粒免疫小鼠体内产生特异性抗体。结论　所构建的重组真核表达质粒pcDE6能引起免疫动物的特异性体液免疫反应 ,应进一步研究其刺激机体的细胞免疫应答 ,以用于结核病 (TB) 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 基因疫苗 免疫原性 ESAT-6
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：5
8
作者 骆旭东 朱道银 +2 位作者 陈全 蒋英 江山 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期592-594,共3页
目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.... 目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B MPT64 融合基因 dna疫苗
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佐剂DDA和MPL对提高结核杆菌组合DNA疫苗免疫效果的比较研究 被引量：7
9
作者 余大海 蔡宏 朱玉贤 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第8期765-770,共6页
编码结核杆菌3种抗原Ag85B,MPT64,MPT83的基因片段插入真核表达载体作为组合疫苗免疫小鼠,DDA和MPL作为佐剂分别提高了此三价苗的免疫原性和免疫保护效果,且相比之下DDA优于MPL.添加DDA后,Ag85B,MPT64,MPT83抗原特异的IFN-γ含量分别为(... 编码结核杆菌3种抗原Ag85B,MPT64,MPT83的基因片段插入真核表达载体作为组合疫苗免疫小鼠,DDA和MPL作为佐剂分别提高了此三价苗的免疫原性和免疫保护效果,且相比之下DDA优于MPL.添加DDA后,Ag85B,MPT64,MPT83抗原特异的IFN-γ含量分别为(265.37±79.2)U/ml,(185.31±58.3)U/ml,(108.13±54.4)U/ml,分别比非佐剂组的高16U/ml,45U/ml和2U/ml,与MPL组3种抗原特异性IFN-γ的含量无显著差异.IL-4的含量在各组中无显著差异.攻毒后细菌计数结果显示,添加佐剂的三价苗组小鼠的肺脏和脾脏的载菌量分别比空载体组降低了2￣3个数量级,且佐剂DDA组显著优于佐剂MPL组和未加佐剂组.病理切片结果与载菌量数据相一致,添加佐剂组,特别是DDA组小鼠肺部淋巴细胞相对减少,巨噬细胞增多.因此,DDA作为佐剂能显著提高核酸疫苗的免疫效率,佐剂MPL不能提高结核杆菌多价核酸疫苗的免疫效率. 展开更多
关键词 结核分支杆菌 组合疫苗 佐剂 DDA MPL 免疫效果
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ESAT6抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答 被引量：7
10
作者 王庆敏 胡振林 +3 位作者 周凤娟 肖存杰 章建程 孙树汉 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期642-645,共4页
目的?构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗,并观察其在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答。方法:构建结核杆菌 ESAT6抗原DNA疫苗pVAX-ESAT6,并将其肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,用ELISA方法检测小鼠的血清抗体(IgG、 IgG2a/IgG1)水平,并在体外用特... 目的?构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗,并观察其在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答。方法:构建结核杆菌 ESAT6抗原DNA疫苗pVAX-ESAT6,并将其肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,用ELISA方法检测小鼠的血清抗体(IgG、 IgG2a/IgG1)水平,并在体外用特异抗原刺激小鼠脾细胞,检测其分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释 放法测定小鼠细胞毒性T淋巴细胞反应。结果:pVAX-ESAT6DNA疫苗诱导了抗原特异的体液免疫应答和细胞免疫应答, 抗体亚型检测显示IgG2a与IgG1的比值为(2.28±0.4),脾细胞分泌的细胞因子水平检测显示IFN-γ的水平(360±45pg/ml) 高于IL-4的水平(124±16pg/ml)。结论:成功地构建了pVAX-ESAT6DNA疫苗,它能在小鼠中诱导抗原特异的免疫应答, 应答类型以Th1型占优势。 展开更多
关键词 ESAT6抗原 dna疫苗 小鼠 诱导 免疫应答
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Th1型细胞因子基因对结核分枝杆菌基因疫苗诱导BALB/c小鼠产生抗CFP10抗体水平的影响 被引量：6
11
作者 范雄林 王丽梅 +5 位作者 王福祥 师长宏 李元 薛莹 柏银兰 徐志凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期260-262,共3页
目的 :研究分别表达含IL 12和IL 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)H3 7Rv 株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单个核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体 ... 目的 :研究分别表达含IL 12和IL 18基因的质粒 ,对结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)H3 7Rv 株CFP10基因疫苗诱导免疫应答的影响。方法 :从正常人外周血单个核细胞 (PMBCs)中提取RNA ,用RT PCR扩增IL 18cDNA ,并克隆入载体 pGEM Teasy中。测序证实后 ,亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1的BamHI和EcoRI酶切位点。将分别表达小鼠IL 12和人IL 18基因的真核表达质粒pcmIL12和pcIL18,与MTBCFP10基因疫苗联合肌注免疫BALB/c小鼠 ,共免疫 3次 ,每次间隔 2wk。每次免疫后 2wk采血、分离血清 ,用ELISA检测小鼠血清抗CFP10抗体的滴度。结果 :用RT PCR成功地从人PMBC的RNA中扩增出IL 18cDNA ,测序结果正确。用BamHI和EcoRI酶切鉴定证实 ,目的基因已插入载体 pcDNA3.1中 ,阳性克隆命名为pcIL18。pc CFP10组第 1次免疫后 ,血清抗CFP10抗体的平均滴度为 1∶6 0 0 ,末次免疫后的滴度为 1∶4 0 0 0。pcIL18+pcCFP10组联合免疫后 ,血清抗CFP10抗体的滴度高于 pcCFP10组 ,最终达 1∶80 0 0。而pcmIL12 + pcCFP10组联合免疫后滴度仅为 1∶2 0 0。结论 :pcIL18与CFP10基因疫苗联合免疫 ,可增强CFP10抗原的特异性体液免疫应答 ;pcmIL12则可使CFP10基因疫苗产生的抗体水平降低。pcIL18+ pcCFP10基因联合免疫是否具有? 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 CFP10 基因疫苗 IL—12 IL—18
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结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较 被引量：6
12
作者 骆旭东 朱道银 +2 位作者 陈全 蒋英 江山 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第17期1630-1631,共2页
目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因... 目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 . 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 AG85B MPT64 dna疫苗
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结核杆菌pIHSP65真核表达载体的构建和表达 被引量：7
13
作者 李岩 邓军霞 管大伟 《新乡医学院学报》 CAS 2007年第1期29-33,共5页
目的构建结核杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)基因真核表达载体pIHSP65,并在Hela细胞中表达。方法从结核杆菌H37Rv株的基因组中扩增HSP65基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点A中,构建pIHSP65真核表达载体,采用阳离子多聚体将... 目的构建结核杆菌热休克蛋白65KD(HSP65)基因真核表达载体pIHSP65,并在Hela细胞中表达。方法从结核杆菌H37Rv株的基因组中扩增HSP65基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点A中,构建pIHSP65真核表达载体,采用阳离子多聚体将其转染到Hela细胞中,用免疫组化染色法检测HSP65基因的表达。结果所克隆的HSP65基因片段经测序完全正确。重组质粒转染Hela细胞后,用免疫组化染色法检测有HSP65蛋白的表达。结论成功构建了结核杆菌pIHSP65真核表达载体,并在Hela细胞中有效表达,为构建双抗原双顺反子真核表达质粒,以及在整体动物水平的实验研究奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 真核表达载体 热休克蛋白65KD dna疫苗
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针对潜伏结核感染的A39 DNA疫苗构建及其免疫原性研究 被引量：6
14
作者 宋娜 李光华 +3 位作者 黄琪 孔聪 王洪海 徐颖 《微生物与感染》 2015年第1期19-27,共9页
选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAXI/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39),并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX... 选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAXI/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39),并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1/Ag85A(A);PCR扩增Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425(A3);PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39)。将构建成功的重组质粒转入HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL/6小鼠,共分为5组:PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应[γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)高水平分泌],外周血CD4^+/CD8^+T细胞比值增加,CD8^+穿孔素^+T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 dna疫苗 潜伏结核感染 Rv2029c Rv3425 AG85A
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结核分枝杆菌Ag85B-Fc2a DNA疫苗的免疫原性及免疫保护性评价
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作者 王天松 杨媛 +4 位作者 姚思 杨雨欣 王婧 张炜 万巧凤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2024年第7期806-810,816,共6页
目的 评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性,以期为该疫苗的研发提供实验依据。方法 将重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a经双酶切和测序鉴定后,转染CHO-K1细胞,采用Western... 目的 评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内产生的免疫原性及免疫保护性,以期为该疫苗的研发提供实验依据。方法 将重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a经双酶切和测序鉴定后,转染CHO-K1细胞,采用Western blot法检测融合蛋白Ag85B-Fc2a的表达。将载体pcDNA3.1(+)及重组质粒pcD-Ag85BFc2a经大腿肌内分别注射雌雄C57BL/6J小鼠(对照组及免疫组),每组10只,初次免疫后2周进行加强免疫。初次免疫后14、28及42 d,经小鼠眼眶采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清中IgG抗体效价;初次免疫后42 d,无菌取小鼠脾脏,制备为单细胞悬液,采用流式细胞术检测CD4^(+)及CD8^(+)T细胞比例;初次免疫后42 d,经尾静脉注射M.tb H37Ra,10~6 CFU/只,攻毒28 d后,断颈处死小鼠,无菌分离小鼠肺脏及脾脏,采用平板法检测左侧肺脏及脾脏荷菌数,金胺O荧光染色法检测右侧肺脏的荷菌情况。结果 经双酶切及测序鉴定,重组质粒pcD-Ag85B-Fc2a构建正确,转染CHO-K1细胞后,可检测到相对分子质量约70 000的融合蛋白Ag85B-Fc2a。初次免后14、28、42d,免疫组小鼠血清Ag85B特异性IgG抗体效价分别为1:3 200、1:12 160、1:12 800,对照组小鼠血清中均未检测到抗体效价。初次免疫后42 d,对照组及免疫组小鼠脾脏中CD4+T细胞比例分别为(23.61±0.64)%及(26.92±0.80)%,CD8^(+)T细胞比例分别为(14.12±0.87)%及(18.78±0.94)%,差异均有统计学意义(t分别为3.23和3.64,P均<0.05)。M.tb H37Ra感染28 d,对照组及免疫组小鼠左侧肺脏荷菌数分别为(4.73±0.13)及(3.81±0.14) CFU,脾脏荷菌数分别为(5.02±0.19)及(4.30±0.13) CFU,差异均有统计学意义(t分别为4.65和3.12,P均<0.01);右侧肺脏荷菌情况与左侧一致。结论 Ag85B-Fc2a DNA疫苗在小鼠体内可诱导特异性体液及细胞免疫效应,对M.tb H37Ra感染可产生良好的保护力。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 dna疫苗 体液免疫 细胞免疫 保护力
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结核分枝杆菌Ag85B DNA疫苗免疫效果的初步评价 被引量：4
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作者 王娜 刘琼 +5 位作者 杨雨欣 李慧 张炜 马国荣 陈耀庚 万巧凤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1427-1431,共5页
目的初步评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B DNA疫苗的免疫效果。方法对含HSV2-gD信号肽基因和Rv1886c基因(共963 bp核苷酸序列)的重组质粒pcD-sRv1886c进行双酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pcD-s Rv1886... 目的初步评价结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Ag85B DNA疫苗的免疫效果。方法对含HSV2-gD信号肽基因和Rv1886c基因(共963 bp核苷酸序列)的重组质粒pcD-sRv1886c进行双酶切和测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pcD-s Rv1886c转染CHO细胞,Western blot法检测CHO细胞培养液中Ag85B蛋白的表达情况。将重组质粒pcD-sRv1886c经肌肉注射免疫C57BL/6J小鼠,共免疫2次,间隔14 d,首次免疫后14、28及42 d经小鼠眼眶后静脉丛采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中IgG及IgG1抗体效价;首次免疫后42 d无菌取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,流式细胞术检测分泌IFNγ^(+)的CD4^(+)T及CD8+T细胞比例,CCK8法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果双酶切和测序鉴定证明重组质粒pcD-sRv1886c构建正确,转染CHO细胞后表达的蛋白可与鼠抗Ag85B单克隆抗体发生特异性结合。首次免疫后14 d,重组质粒免疫组小鼠血清中IgG及IgG1特异性抗体效价分别为1∶1720和1∶460,28 d后为1∶5760和1∶2560,42 d后为1∶6080和1∶2720。首次免疫后42 d,重组质粒免疫组和PBS阴性对照组小鼠脾细胞中CD3^(+)CD4^(+)IFNγ^(+)细胞比例分别为(2.03±0.23)%和(0.14±0.02)%,CD3^(+)CD8+IFNγ^(+)细胞比例分别为(1.05±0.08)%和(0.13±0.01)%,差异均有统计学意义(t分别为18.38和11.58,P均<0.001)。重组质粒免疫组小鼠脾淋巴细胞SI为5.02,明显高于PBS对照组(1.06),且差异有统计学意义(t=15.66,P<0.001)。结论M.tb Ag85B DNA疫苗可有效诱导机体产生体液免疫及细胞免疫效应。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 dna疫苗 Ag85B蛋白
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MPT63核酸疫苗的制备及其免疫原性 被引量：4
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作者 潘怡 蔡宏 +2 位作者 李淑霞 李唐 朱玉贤 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期205-209,共5页
扩增结核分枝杆菌分泌蛋白MPT63编码序列 ,克隆于真核表达载体pJW 4 30 3中 .转染COS 7细胞 ,用Western印迹检测表明该基因在细胞内得到正确表达 .用该质粒连续免疫C5 7BL 6小鼠 3次后 ,用纯化的重组蛋白MPT63检测小鼠血清中的抗体 ,发... 扩增结核分枝杆菌分泌蛋白MPT63编码序列 ,克隆于真核表达载体pJW 4 30 3中 .转染COS 7细胞 ,用Western印迹检测表明该基因在细胞内得到正确表达 .用该质粒连续免疫C5 7BL 6小鼠 3次后 ,用纯化的重组蛋白MPT63检测小鼠血清中的抗体 ,发现抗体滴度达到 10 5,免疫动物中γ干扰素的含量达到 2 5 8± 0 2U ml ,为空载体DNA免疫对照组的 2 0倍以上 。 展开更多
关键词 MPT63 核酸疫苗 制备 免疫原性 结核病 结核分枝杆菌 分泌蛋白
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表达结核分枝杆菌融合蛋白的DNA疫苗构建及免疫保护 被引量：5
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作者 朱中元 王海波 +4 位作者 谢勇 陈英兰 郑冰冰 张春发 张颖 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期47-50,共4页
目的评价构建的结核DNA疫苗pVS3in1免疫的小鼠体外产生细胞因子能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。方法将结核菌mtb8.4、Mr38 000和ag85b插入pVAX1载体,构建表达结核菌Mtb8.4-Mr38 000 CTL表位-Ag85B融合蛋白的DNA疫苗pVS3in1。... 目的评价构建的结核DNA疫苗pVS3in1免疫的小鼠体外产生细胞因子能力和抵抗结核分枝杆菌H37Rv攻击的效果。方法将结核菌mtb8.4、Mr38 000和ag85b插入pVAX1载体,构建表达结核菌Mtb8.4-Mr38 000 CTL表位-Ag85B融合蛋白的DNA疫苗pVS3in1。将雌性C57BL/6小鼠分成5组,每组20只,分别用pVS3in1、pVAX1、pIL2S和PBS免疫3次,每隔2周。另一组用BCG(105CFU)皮内免疫1次。每组10只鼠在最后1次免疫后,培养脾细胞,检测上清液细胞因子。另10只用结核菌H37Rv经静脉攻击,2周后取脾、肝和肺培养结核菌并计数。结果pVS3in1组鼠脾细胞培养上清液mIL-2和mIFN-γ含量分别为(379.6±58.2)pg/mL和(529.7±63.7)pg/mL,显著高于3个阴性对照组(P<0.001),与BCG组无显著性差异(P>0.05)。5组的mIL-6和mIL-10无显著性差异。pVS3in1组的脾、肝和肺结核菌载量分别为(17 443.6±3 202.5),(19 047.2±3 395.5)和(14 822.2±2 882.2)CFU/g,低于pVAX1、pIL2S和PBS等3组相应器官的载量(P<0.001),仅脾菌落数显著高于BCG组。结论pVS3in1能够刺激机体产生抗结核菌所需的Th1型免疫应答,诱导小鼠抵抗H37Rv攻击的能力与BCG相当。 展开更多
关键词 结核 dna疫苗 融合蛋白 细胞因子 免疫保护
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结核杆菌ESAT-6抗原多表位DNA疫苗的构建与表达 被引量：4
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作者 陈霞 徐闻欢 +2 位作者 徐娟 赵聃 王迎伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期412-415,共4页
目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Flt3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达。方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tyr(AAY)序列作为接头,合成全... 目的:构建含3个结核杆菌ESAT-6抗原T细胞表位及Flt3配体基因的重组质粒,并使其在大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)中表达。方法:用计算机软件预测结核杆菌ESAT-6抗原的T细胞表位谱,选取3个T细胞表位,并以Ala-Ala-Tyr(AAY)序列作为接头,合成全基因序列,定向克隆入真核双表达载体pIRES及质粒pIRES-FL。在酶切分析与序列测定后,用PEI转染至GMCs细胞,并行Western blot鉴定其体外表达。结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,Western blot证实该重组质粒能在体外GMCs细胞中表达融合蛋白。结论:成功构建了结核杆菌ESAT-6抗原多表位基因重组质粒。 展开更多
关键词 结核杆菌 ESAT-6 T细胞表位 dna疫苗
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结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6的构建、鉴定及免疫效应评价 被引量：4
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作者 王雪梅 王英 +5 位作者 薛玉芹 陈勇 陶志勇 夏惠 唐洁 方强 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期945-950,共6页
目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-... 目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6特异性抗体IgG的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组(空质粒组和生理盐水对照组)明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对照组(空质粒组和生理盐水对照组)。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫效应。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ESAT-6 dna疫苗 细胞免疫 体液免疫
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