为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利...为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与载体pGADT7-Rec共转化入酵母菌Y187感受态中,在缺少亮氨酸的培养基(SD-Leu with agar)上培养收集所有克隆。经鉴定,cDNA文库的转化效率为5.6×10~6cfu·μg^(-1),文库容量为2.4×10~7cfu,文库滴度为4.9×10~8cfu·mL^(-1),平均插入片段长度大于1000bp,重组率为100%。随机挑取20个单克隆测序,比对NCBI数据库分析获得了19个已知蛋白序列和1个未知蛋白序列。已知功能的序列编码的蛋白分为4类,包括酶类蛋白、转录因子、载体蛋白和逆境响应蛋白,参与蛋白质磷酸化、水分运输和氧化还原反应等生物过程,其中7个序列之前被报道参与脱落。结果表明获得该文库质量较高,为筛选番茄花柄脱落过程中的互作蛋白奠定了基础。展开更多
目的:构建羟基喜树碱耐药结肠癌细胞株SW1116/HCPT细胞的酵母双杂交cDNA文库.方法:用TRIzol从SW1116/HCPT细胞提取总RNA,采用CLONTECH SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术和同源重组(homologous recombina...目的:构建羟基喜树碱耐药结肠癌细胞株SW1116/HCPT细胞的酵母双杂交cDNA文库.方法:用TRIzol从SW1116/HCPT细胞提取总RNA,采用CLONTECH SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术和同源重组(homologous recombination)的方法构建SW1116/HCPT细胞的cDNA文库.结果:提取的RNA的A260/A280为1.98,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳示出28SrRNA、18SrRNA及5SrRNA3条特异性带,28S与18S带浓度及亮度比值约为2.文库dscDNAsmear较长分布在0.1-5kb,成长瀑布条带,而且在接近1kb的区域有密集的带子,为高丰度表达基因.依据生长菌落计数,共获得(1.2-1.9)×106个转化子,重组率达93.7%,文库插入片段大小为0.2-5kb.结论:成功构建了SW1116/HCPT cDNA文库.展开更多
目的 利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cDNA文库。方法 利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离...目的 利用SMART（switching mechanism at 5′end of RNA transcript）技术，通过同源重组的方法，在酵母菌株Y187中构建人脑全长cDNA文库。方法 利用SMART技术，以人脑总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。再在DNA聚合酶下，通过长距离PCR，扩增双链cDNA。同时构建pGADT7-Rec质粒载体。纯化的ds cDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态Y187，经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD／-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人脑cDNA文库。结果 所获得的文库容量为1．2×10^6，重组子不同插入片断大小在0．3～2kb之间。结论 在酵母菌株Y187成功构建了用于酵母双杂交的人脑cDNA文库。展开更多
文摘为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与载体pGADT7-Rec共转化入酵母菌Y187感受态中,在缺少亮氨酸的培养基(SD-Leu with agar)上培养收集所有克隆。经鉴定,cDNA文库的转化效率为5.6×10~6cfu·μg^(-1),文库容量为2.4×10~7cfu,文库滴度为4.9×10~8cfu·mL^(-1),平均插入片段长度大于1000bp,重组率为100%。随机挑取20个单克隆测序,比对NCBI数据库分析获得了19个已知蛋白序列和1个未知蛋白序列。已知功能的序列编码的蛋白分为4类,包括酶类蛋白、转录因子、载体蛋白和逆境响应蛋白,参与蛋白质磷酸化、水分运输和氧化还原反应等生物过程,其中7个序列之前被报道参与脱落。结果表明获得该文库质量较高,为筛选番茄花柄脱落过程中的互作蛋白奠定了基础。
文摘目的:构建羟基喜树碱耐药结肠癌细胞株SW1116/HCPT细胞的酵母双杂交cDNA文库.方法:用TRIzol从SW1116/HCPT细胞提取总RNA,采用CLONTECH SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术和同源重组(homologous recombination)的方法构建SW1116/HCPT细胞的cDNA文库.结果:提取的RNA的A260/A280为1.98,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳示出28SrRNA、18SrRNA及5SrRNA3条特异性带,28S与18S带浓度及亮度比值约为2.文库dscDNAsmear较长分布在0.1-5kb,成长瀑布条带,而且在接近1kb的区域有密集的带子,为高丰度表达基因.依据生长菌落计数,共获得(1.2-1.9)×106个转化子,重组率达93.7%,文库插入片段大小为0.2-5kb.结论:成功构建了SW1116/HCPT cDNA文库.
