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靶向RelA(p65)基因shRNA慢病毒载体构建及功能鉴定
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作者 霍云飞 高明慧 +4 位作者 豆双双 寇卜心 柴梦音 刘晓霓 石英 《中国临床新医学》 2023年第9期907-912,共6页
目的构建靶向RelA(p65)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并对其功能进行验证。方法设计3对针对RelA基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落... 目的构建靶向RelA(p65)基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,并对其功能进行验证。方法设计3对针对RelA基因的RNA干扰序列,并合成相应的shRNA序列。shRNA退火形成双链oligo序列后应用基因重组技术构建重组质粒,经菌落聚合酶链式反应(PCR)及测序鉴定,将重组正确的质粒进行慢病毒包装和滴度测定,通过Western blot实验筛选出对HepG2细胞株中RelA基因干扰效果最好的慢病毒,并通过CCK-8检测Lenti-shRelA对细胞增殖活性的影响。结果测序结果显示重组慢病毒载体与设计参考序列一致,提示重组慢病毒载体构建成功。重组慢病毒Y4056、Y21318、Y21319、Y21320的滴度分别为3.13×10^(8)TU/ml、2.97×10^(8)TU/ml、2.51×10^(8)TU/ml、3.40×10^(8)TU/ml。用慢病毒Lenti-shRelA(Y21318、Y21319、Y21320、Y4056)感染HepG2细胞,Western blot实验结果显示Y21320对HepG2细胞株中RelA基因的干扰效果最好。CCK-8实验结果显示RelA的敲降可显著抑制细胞增殖活力。结论该研究成功构建了靶向RelA基因shRNA慢病毒载体,其能有效下调HepG2细胞RelA的表达并抑制细胞增殖,为进一步研究RelA在肝癌发生、发展中的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 RelA基因 短发夹RNA 慢病毒 肝癌
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短发夹RNA表达载体对2型单纯疱疹病毒UL54基因的干扰效应 被引量：1
2
作者 吕延成 潘晓瑜 +1 位作者 樊俊 黄畅 《中国临床研究》 CAS 2014年第8期901-903,906,F0002,共5页
目的研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因的干扰效应。方法针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(shRNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计... 目的研究短发夹核糖核酸(shRNA)表达载体对2型单纯疱疹病毒(HSV-2)UL54基因的干扰效应。方法针对HSV-2 UL54基因,构建5个靶向HSV-2 UL54基因的短发夹RNA重组表达载体(shRNA1081、shRNA1092、shRNA1276、shRNA1407、shRNA1508),同时设计不针对任何基因的序列为阴性对照组(阴性对照组)及不加任何重组表达载体的空白对照(空白对照组)。重组表达载体通过脂质体转染人胚胎肾细胞(HEK293)后接种HSV-2,48 h后利用荧光定量RT-PCR检测各组细胞UL54 mRNA的表达水平,终点滴定法测定HSV-2子代病毒滴度。结果荧光定量RT-PCR结果示,与空白对照组相比,shRNA1081、shRNA1407和shRNA1508能够降低HSV-2 UL54 mRNA的表达水平(P均<0.01);对UL54基因的抑制率在阴性对照组(加shRNA NC)、shRNA1081组、shRNA1407组、shRNA1508组分别为7%、69%、56%及55%,以shRNA1081组为最高。终点滴定法结果示,与空白对照组比较,shRNA 1081组、shRNA 1407组、shRNA 1508组病毒滴度不同程度下降(P均<0.01)。结论成功构建UL54 shRNA重组表达载体,shRNA1081、shRNA1407、shRNA1508能在体外细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL54基因表达,从而抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。 展开更多
关键词 短发夹核糖核酸 核糖核酸干扰 2型单纯疱疹病毒 UL54基因
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一种新的非Gal异种移植抗原——FAM234A的鉴定
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作者 谢崇伟 戴文杰 +2 位作者 张军方 蔡志明 牟丽莎 《器官移植》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期354-359,共6页
目的探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未... 目的探讨FAM234A是否为一种新的非Gal异种移植抗原。方法用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪的原代猪主动脉内皮细胞(PAEC)免疫食蟹猴。将免疫的猴血清与PAEC孵育,其中经免疫产生的猴抗猪细胞抗体能够识别并结合PAEC表面的未知抗原。采用流式细胞术测定PAEC表面结合的猴抗猪细胞抗体的平均荧光强度(MFI),用以表示PAEC表面抗原的含量。利用慢病毒介导的短发夹核糖核酸(shRNA)敲减PAEC中的FAM234A基因,检测该细胞结合的猴抗猪细胞抗体含量是否减少,以确定该基因是否为潜在的移植抗原。结果 PAEC中的非Gal抗原能够在猴体内引发大量的猴抗猪细胞抗体。在GTKO小型猪的PAEC中用shRNA敲减FAM234A基因后,PAEC结合的猴IgG抗体减少。结论 FAM234A是一种新的非Gal异种移植抗原。 展开更多
关键词 异种移植 非Gal抗原 主动脉内皮细胞(PAEC) FAM234A 食蟹猴 α-1 3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO) 流式细胞术 短发夹核糖核酸(shrna) 基因敲减 巴马小型猪 五指山小型猪 慢病毒
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