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猪水肿病志贺样毒素大肠杆菌的分离与鉴定 被引量：6
1
作者 王红珍 艾虎 +2 位作者 吴拥军 冉雪琴 王嘉福 《西南农业学报》 CSCD 2004年第3期378-381,共4页
大肠杆菌产生的志贺样毒素Ⅱ型突变体(Shiga liketoxinvariant,SLTⅡv)是猪水肿病的主要致病因子。采用聚合酶链式反应,以特异的寡核苷酸片段为引物,从200份贵州省患水肿病猪粪样中检出19株菌株含有志贺样毒素Ⅱ型突变体基因,生化实验... 大肠杆菌产生的志贺样毒素Ⅱ型突变体(Shiga liketoxinvariant,SLTⅡv)是猪水肿病的主要致病因子。采用聚合酶链式反应,以特异的寡核苷酸片段为引物,从200份贵州省患水肿病猪粪样中检出19株菌株含有志贺样毒素Ⅱ型突变体基因,生化实验结果符合大肠埃希氏杆菌的特点。经鉴定,19株大肠杆菌分属于O8、O65、O82、O1394种血清型,其中O82占63%。研究结果证实,在贵州省猪水肿病中存在志贺样毒素基因。 展开更多
关键词 大肠杆菌 猪水肿病 志贺样毒素Ⅱ型突变体基因
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志贺样毒素IIeA酶活性位点基因突变株的构建与表达
2
作者 徐建生 成大荣 +2 位作者 陈雷 董国雄 李俊宝 《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 CAS CSCD 2004年第4期61-64,共4页
利用重叠延伸PCR法对志贺样毒素 型变异体A亚单位(SLT- eA)基因进行修饰扩增,将第167位编码Glu的密码子突变为Gln的密码子,第170位编码Arg的密码子突变为编码Lys密码子,并用质粒载体pGEX-6P-1在大肠杆菌BL21中进行融合表达,在不改变其... 利用重叠延伸PCR法对志贺样毒素 型变异体A亚单位(SLT- eA)基因进行修饰扩增,将第167位编码Glu的密码子突变为Gln的密码子,第170位编码Arg的密码子突变为编码Lys密码子,并用质粒载体pGEX-6P-1在大肠杆菌BL21中进行融合表达,在不改变其蛋白空间构象的同时降低其毒性。重组SLT- eA突变株pGEX-Amu的大量表达为研究SLT- eA在体内的生物学特性提供依据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 PCR 志贺样毒素 Ⅱ型变异体型A亚单位 突变
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SLT-Ⅱe对PIMVECs分泌炎症反应相关细胞因子的影响 被引量：1
3
作者 王伟然 施晓杰 +1 位作者 张蒙 穆祥 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第11期3467-3473,共7页
本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)处理后,猪小肠微血管内皮细胞(PIMVECs)分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)、P选择素(P-selectin)、一氧化氮(NO)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和内皮素(ET)水平的变化。采用超速离心法提取... 本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)处理后,猪小肠微血管内皮细胞(PIMVECs)分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-ɑ)、P选择素(P-selectin)、一氧化氮(NO)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和内皮素(ET)水平的变化。采用超速离心法提取SLT-Ⅱe,采用BCA试剂盒测定其质量浓度,使用SDS-PAGE及Western blotting验证蛋白纯度;用WST-1法从0.1、0.5、1、5、10μg/mL SLT-Ⅱe和0、2、4、8、12、24 h中筛选出SLT-Ⅱe对PIMVECs最佳作用浓度与时间;ELISA法检测对照组(0μg/mL SLT-Ⅱe)和试验组(1μg/mL SLT-Ⅱe)细胞上清中TNF-ɑ、P-selectin、NO、ICAM-1和ET含量的变化。结果表明:所提蛋白为SLT-Ⅱe,蛋白含量为721.75μg/mL;1μg/mL的SLT-Ⅱe作用8 h后可极显著降低PIMVECs的活性(P<0.01);1μg/mL的SLT-Ⅱe作用9和12 h时PIMVECs的TNF-ɑ分泌量显著升高(P<0.05),NO/ET的值显著高于对照组(P<0.05),作用6、9、12 h时P-selectin的含量显著升高(P<0.05),作用12 h时的ICAM-1分泌量显著升高(P<0.05)。综上所述,SLT-Ⅱe浓度为1μg/mL时可以诱导PIMVECs分泌的TNF-ɑ、P-selectin、ICAM-1以及NO/ET上升,为研究仔猪水肿病发病机制提供参考。 展开更多
关键词 志贺样毒素Ⅱ型变异体 小肠微血管内皮细胞 炎症反应细胞因子 猪
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海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究
4
作者 洪小花 朱润芝 +4 位作者 庞全海 李宏全 高崧 杨宏伟 丁永龙 《吉林畜牧兽医》 2005年第3期6-10,12,共6页
对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在海安地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%-1.84%,死亡率为0.07%-0.56%,病死率为16.0%-35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生... 对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在海安地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%-1.84%,死亡率为0.07%-0.56%,病死率为16.0%-35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6,F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5+F411株(O93),F41+F181株(O139),F5+F41+F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离株对壮观霉素和新霉素高度敏感。 展开更多
关键词 分离株 SLT 流行病学 多发 E基因 多重PCR检测 发病 猪水肿病 病原特性 病料
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利用PCR法鉴定产SLT-IIe大肠杆菌 被引量：24
5
作者 徐建生 成大荣 +1 位作者 董国雄 李俊宝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第5期339-340,共2页
类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体（ Ｓｈｉｇａｌｉｋｅ Ｔｏｘｉｎ Ⅱ Ｖａｒｉａｎｔ， Ｓ Ｌ ＴⅡｖ ｏｒ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ），是仔猪水肿病的主要致病因子。根据 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 基因序列，合成一对针对 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 操纵子基... 类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体（ Ｓｈｉｇａｌｉｋｅ Ｔｏｘｉｎ Ⅱ Ｖａｒｉａｎｔ， Ｓ Ｌ ＴⅡｖ ｏｒ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ），是仔猪水肿病的主要致病因子。根据 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 基因序列，合成一对针对 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 操纵子基因保守区的寡核苷酸引物，建立了聚合酶链式反应（ Ｐ Ｃ Ｒ）扩增方法。通过对产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 毒素大肠杆菌菌株 Ｔ Ｂ１、产 Ｓ Ｌ ＴⅡ毒素大肠杆菌菌株 ９３３ Ｗ 和产 Ｓ Ｌ ＴⅠ毒素大肠杆菌菌株 Ｈ３０ 的试验，结果表明用所设计的引物建立的 Ｐ Ｃ Ｒ方法可特异性鉴定产 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 大肠杆菌。用此法对本实验室从患水肿病仔猪肠道分离的 １５ 株大肠杆菌进行了鉴定，结果可从 １５ 个菌株的 １２ 株中扩增到 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ 的特异性保守序列基因片段，而其它菌株未见此保守序列的基因片段。 展开更多
关键词 猪 水肿病 大肠杆菌 SLT-Ⅱe 特异序列 PCR
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重组融合蛋白GST SLT ⅡeB表达条件的研究 被引量：14
6
作者 徐建生 成大荣 +2 位作者 陈雷 董国雄 李俊宝 《扬州大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 1999年第4期27-30,共4页
通过在不同温度、不同诱导时间、不同异丙基硫代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ） 诱导浓度条件下，对重组大肠杆菌ＰＰＳＬＴ ⅡｅＢ 表达的谷胱甘肽 Ｓ 转移酶（ＧＳＴ） 与类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体Ｂ 亚单位（ＳＬＴ ⅡｅＢ） 的融合蛋... 通过在不同温度、不同诱导时间、不同异丙基硫代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ） 诱导浓度条件下，对重组大肠杆菌ＰＰＳＬＴ ⅡｅＢ 表达的谷胱甘肽 Ｓ 转移酶（ＧＳＴ） 与类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体Ｂ 亚单位（ＳＬＴ ⅡｅＢ） 的融合蛋白（ＧＳＴ ＳＬＴ ⅡｅＢ） 的分析，结果表明：在所试条件中，温度是影响表达的主要因素，重组大肠杆菌（ＰＰＳＬＴ ⅡｅＢ） 在２８ ℃温度条件下，可以明显表达融合蛋白ＧＳＴ ＳＬＴ ⅡｅＢ． 在ＩＰＴＧ 为１ｍｍｏｌ·Ｌ－ １ 浓度条件下，２ ｈ 的诱导即可获得明显表达． 在所试几种ＩＰＴＧ 诱导浓度下，通过５ ｈ 的诱导，均可获得明显表达．４００ ｍＬ２ＸＹＴＡ 培养基产生的融合蛋白在１ ．８ ｍｇ 以上． 展开更多
关键词 变异体 融合蛋白 水肿病 GST-SLT-ⅡeB 仔猪
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大肠杆菌SLT-IIvB基因的克隆和表达 被引量：6
7
作者 倪振亚 焦新安 +2 位作者 高崧 张如宽 刘秀梵 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期591-597,共7页
采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从大肠杆菌O1 38基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因 ,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd+)的EcoRI、BamHI位点之间 ,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X62 1... 采用聚合酶链式反应 (PCR) ,从大肠杆菌O1 38基因组DNA中分别扩增出志贺菌样毒素II型变体B的结构序列和包括信号肽的全序列两段基因 ,定向克隆进表达载体质粒pYA3334(asd+)的EcoRI、BamHI位点之间 ,构建成重组表达质粒。在大肠杆菌X62 1 2(Δasd)筛选出重组质粒 pB0 和 pB1 后 ,经中间宿主X3730转化过渡 ,再导入ΔasdΔcyaΔcrp减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 ,构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的SLT IIvB重组菌。SDS PAGE和Western blot分析重组菌X4550 ( pB0 )在 7 6kD左右处有一条特异性蛋白条带。动物免疫试验表明该重组菌能刺激机体产生针对SLT IIvB和沙门氏菌的特异性抗体。这为进一步研制相应的抗猪水肿病及相应沙门氏菌病的双价活疫苗奠定了重要基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 SLT-IIvB基因 重组疫苗载体
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类志贺氏菌毒素Ⅱ型变异体B亚单位基因的表达与鉴定 被引量：13
8
作者 成大荣 徐建生 +1 位作者 董国雄 李俊宝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第5期349-353,共5页
将由 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增并克隆在ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中的ｓｌｔⅡｅ Ｂ基因切出，并按预定的阅读框架插入表达性质粒载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ６ｐ１ 中的谷胱苷肽转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ）基因的下游。重组质粒 ｐｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ在大肠杆... 将由 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增并克隆在ｐ Ｕ Ｃ１８ 质粒载体中的ｓｌｔⅡｅ Ｂ基因切出，并按预定的阅读框架插入表达性质粒载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ６ｐ１ 中的谷胱苷肽转移酶（ Ｇ Ｓ Ｔ）基因的下游。重组质粒 ｐｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１ 中以融合蛋白的形式表达 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（命名为 Ｇ Ｓ Ｔ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ），即 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ蛋白（７５６８ｋ Ｄ）与谷胱苷肽转移酶（２７３３５ｋ Ｄ）相连组成分子量为 ３４８８５ｋ Ｄ 的融合蛋白。通过对重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ的菌体裂解物的 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳分析，以及根据抗原抗体结合反应的免疫学特性，通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 鉴定，重组大肠杆菌 Ｐ Ｐ Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ（含有重组质粒 ｐｐｓｌｔⅡｅ Ｂ的大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１）可以大量表达融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ。根据 Ｇ Ｓ Ｔ 可与其底物谷胱苷肽结合的特性，用谷胱苷肽结合的 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ制备的亲和凝胶纯化表达产物，纯化的表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ，可以鉴定到分子量约为 ３５ｋ Ｄ 的蛋白条带，这与融合蛋白形式的 Ｓ Ｌ ＴⅡｅ Ｂ分子量（３４８８５ｋ Ｄ）相当。 展开更多
关键词 猪 水肿病 SIL-ⅡeB 融合蛋白 基因表达
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志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用 被引量：4
9
作者 杨鹭花 董国雄 李俊宝 《中国兽医科技》 CSCD 1999年第3期6-9,共4页
应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得１株针对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体（ＳｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎⅡｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＴⅡｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞，并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离... 应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得１株针对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体（ＳｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎⅡｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＴⅡｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞，并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株，发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应，与产ＳＬＴⅡ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应，但与产ＳＬＴⅠ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ３２５１１）均无反应。这表明该法能特异、敏感、简便、快速地鉴定产ＳＬＴⅡｖ的大肠埃希氏菌。 展开更多
关键词 猪 水肿病 志贺氏菌样毒素 Ⅱ型变异体
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