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Slfn1对大鼠平滑肌细胞增殖的影响及机制
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作者 刘姿麟 肖森桐 况春燕 《贵州医科大学学报》 CAS 2024年第7期988-996,共9页
目的探讨睡眠因子1(Slfn1)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及机制。方法麻醉处死56只雄性SD大鼠,剪取腹主动脉到主动脉弓的血管段、分离中膜组织块体外培养4~5 d,采用免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达鉴定平滑肌细... 目的探讨睡眠因子1(Slfn1)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及机制。方法麻醉处死56只雄性SD大鼠,剪取腹主动脉到主动脉弓的血管段、分离中膜组织块体外培养4~5 d,采用免疫荧光法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达鉴定平滑肌细胞;感染复数(MOI)为1×10^(2)、1×10^(3)、1×10^(4)浓度Slfn1的重组腺病毒干扰质粒转染VSMCs 48 h,通过荧光显微镜及流式细胞仪检测不同MOI组VSMCs中有绿色荧光蛋白(eGFP)的细胞/总细胞的百分比,确定最佳MOI用于后续实验,并分为Slfn1干扰组(用Slfn1的重组腺病毒干扰质粒转染)、Slfn1干扰对照组(用Slfn1的重组腺病毒干扰空载体质粒转染)及空白对照组(用正常血清培养),采用聚合酶链式反应(PCR)检测3组Slfn1信使RNA(mRNA)的表达,CCK-8检测VSMCs增殖;提取RNA进行高通量RNA测序、并通过R语言分析,寻找差异基因,对差异基因进行基因本体(GO)和京都基因和基因组数据库(KEGG)富集分析。结果原代培养VSMCs第10~15天时,细胞呈典型的“峰谷”样生长形态,细胞免疫荧光法显示VSMCs胞质内有α-SMA表达,鉴定为VSMCs;Slfn1的重组腺病毒干扰质粒转染VSMCs 48 h后,1×10^(3)MOI组VSMCs中质粒的转染效率高(90%);PCR结果示Slfn1干扰组VSMCs中Slfn1 mRNA表达减少(P<0.05),CCK8结果显示Slfn1干扰组VSMCs增殖增加(P<0.05);用Slfn1重组腺病毒干扰质粒转染VSMCs 48 h,提取RNA进行高通量RNA测序及R语言分析结果显示,差异基因中上调基因94个,下调基因181个;GO和KEGG富集分析显示,Slfn1基因可能通过蛋白质糖基化、mRNA监测通路、鞘脂类信号通路等调控VSMCs的增殖。结论基因干扰VSMCs的Slfn1可促进VSMCs的增殖,其机制可能与蛋白质糖基化、mRNA监测通路及鞘脂类信号通路等调控有关。 展开更多
关键词 大鼠 Sprgue-Dawley 细胞增殖 睡眠因子1 血管平滑肌细胞 蛋白质糖基化
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大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定 被引量：4
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作者 刘姿麟 林慕之 +1 位作者 况春燕 刘兴德 《贵州医科大学学报》 CAS 2017年第2期136-141,146,共7页
目的:构建大鼠睡眠因子1(Slfn1)基因的发夹状RNA质粒,并进行腺病毒载体包装。方法:根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3),并将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶... 目的:构建大鼠睡眠因子1(Slfn1)基因的发夹状RNA质粒,并进行腺病毒载体包装。方法:根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3),并将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体(p DKD-CMV-U6-shRNA)的U6启动子下游,替换掉原来的ccd B基因;利用Admax系统,将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定;利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果:经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确,表明构建质粒成功;腺病毒包装ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及ShRNA-Slfn1(3)的病毒滴度分别为1.0×1014ifu/L,2.5×1014ifu/L,6.3×1013ifu/L,Western Blot证实ShRNA-Slfn1(1)及ShRNA-Slfn1(3)能显著降低转染293T细胞中Flag的表达,确定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)为目的质粒。结论:成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。 展开更多
关键词 睡眠因子1 RNA干扰 腺病毒载体 短发夹RNA 构建 大鼠
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Slfn1通过下调Cyclin D1抑制内皮祖细胞的黏附功能 被引量：3
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作者 况春燕 张璐 +3 位作者 吴强 杨天和 舒金 张萍 《中国动脉硬化杂志》 CAS 北大核心 2016年第1期1-6,共6页
目的探讨睡眠因子1(Slfn1)对内皮祖细胞(EPC)黏附功能的影响。方法实验分为空白对照组(未给予任何处理的EPC,N-control组)、腺病毒阴性对照组(Ad-control组)、Slfn1腺病毒载体组(Ad-Slfn1组)、发夹状RNA阴性对照组(Sh RNA-control组)、... 目的探讨睡眠因子1(Slfn1)对内皮祖细胞(EPC)黏附功能的影响。方法实验分为空白对照组(未给予任何处理的EPC,N-control组)、腺病毒阴性对照组(Ad-control组)、Slfn1腺病毒载体组(Ad-Slfn1组)、发夹状RNA阴性对照组(Sh RNA-control组)、发夹状RNA Slfn1干扰组(Sh RNA-Slfn1组)。分离培养大鼠骨髓源性EPC,用Sh RNA-control质粒、Ad-Slfn1及相应的对照质粒分别转染EPC,采用Western blot检测细胞Slfn1及Cyclin D1表达,将EPC接种在预先铺好纤维连接蛋白的培养板中,观察其黏附功能。用流式细胞仪检测细胞周期。结果Sh RNA-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显低于Sh RNA-control组,Ad-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显高于Ad-control组,说明转染有效。用Sh RNA-Slfn1减弱EPC Slfn1基因的表达明显增强EPC的黏附能力,过表达Slfn1基因则明显抑制EPC的黏附能力。细胞周期检查结果显示,降低EPC Slfn1基因的表达,EPC的细胞周期进入到S期细胞明显增多,过表达Slfn1基因使EPC的细胞周期停止在G1期。Western blot检测结果发现,Sh RNA-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达明显高于Sh RNA-control组,而Ad-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达则明显低于Ad-control组。结论 Slfn1通过下游靶点Cyclin D1负性调控EPC的黏附功能。 展开更多
关键词 睡眠因子1 CYCLIN D1 内皮祖细胞
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