【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将...【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。展开更多
金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳...金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。展开更多
生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PC...生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。展开更多
文摘【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列,在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因,将其连接到PMD19-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线,并进行特异性,灵敏性,重复性及临床样本检测试验,评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增,该方法都呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于2%,表明该方法重现性好;临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法,为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。
文摘金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。
文摘采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×10^9-8.80×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×10^1 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。
