目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性...目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。展开更多
采用荧光显微技术,对2006年长江口及近海水域20个站点的表层及10m层或潜水体冬、春两季的浮游病毒丰度进行了检测,对浮游病毒丰度在季节(冬、春两季)、水平分布和垂直分布上的变化进行了探讨。调查区浮游病毒丰度在冬、春季节上并无明...采用荧光显微技术,对2006年长江口及近海水域20个站点的表层及10m层或潜水体冬、春两季的浮游病毒丰度进行了检测,对浮游病毒丰度在季节(冬、春两季)、水平分布和垂直分布上的变化进行了探讨。调查区浮游病毒丰度在冬、春季节上并无明显差异,但在水平分布上存在很大差异,河口区浮游病毒直接检测量(Virus Direct Count,VDC)达到107个/ml,近海水域VDC为106个/ml,河口区的浮游病毒丰度都明显高于近海水域病毒丰度(P<0.01)。在垂直分布上,冬、春两季长江口水域水深小于10m的站位,表层浮游病毒丰度与底层病毒丰度无明显差别,水深大于10m的站位,表层水样的浮游病毒丰度都高于10m水层病毒丰度,说明长江口浮游病毒的垂直分布与站位总水深有关。还通过比较各站点VDC与叶绿素a含量的数据,分析了二者之间的相关性:冬季浮游病毒丰度与叶绿素a含量成正相关性;春季浮游病毒丰度与叶绿素a含量成负相关性,但病毒丰度受叶绿素a含量的影响仅为10%—11%。展开更多
为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感...为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。展开更多
金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳...金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。展开更多
目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线...目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。展开更多
文摘目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。
文摘采用荧光显微技术,对2006年长江口及近海水域20个站点的表层及10m层或潜水体冬、春两季的浮游病毒丰度进行了检测,对浮游病毒丰度在季节(冬、春两季)、水平分布和垂直分布上的变化进行了探讨。调查区浮游病毒丰度在冬、春季节上并无明显差异,但在水平分布上存在很大差异,河口区浮游病毒直接检测量(Virus Direct Count,VDC)达到107个/ml,近海水域VDC为106个/ml,河口区的浮游病毒丰度都明显高于近海水域病毒丰度(P<0.01)。在垂直分布上,冬、春两季长江口水域水深小于10m的站位,表层浮游病毒丰度与底层病毒丰度无明显差别,水深大于10m的站位,表层水样的浮游病毒丰度都高于10m水层病毒丰度,说明长江口浮游病毒的垂直分布与站位总水深有关。还通过比较各站点VDC与叶绿素a含量的数据,分析了二者之间的相关性:冬季浮游病毒丰度与叶绿素a含量成正相关性;春季浮游病毒丰度与叶绿素a含量成负相关性,但病毒丰度受叶绿素a含量的影响仅为10%—11%。
文摘为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。
文摘金黄色葡萄球菌是引起食物中毒的一种常见的致病菌,而其产生的肠毒素A是乳及乳制品食物中毒事件的主要原因。本研究建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。该方法能快速、稳定地在8h内完成对乳中金黄色葡萄球菌的检测,对人工污染乳中金黄色葡萄球菌检测的最低检出限为83CFU/ml。
文摘目的探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real-time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0.98（除1个样品为0.97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0.8~1.0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2/3样品〉1.2,而后两种染料为0.9~1.2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
